ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
のmiRNAのクローニングおよびハイスループットシークエンシング、のmiR-配列と呼ばれるが、一塩基分解能でmiRNAを定量化するためにトランスクリプトーム全体のアプローチとして単独で立っている。この技術は、miRNA分子の3 'および5'オリゴヌクレオチドアダプターを取り付けることによりmiRNAを捕捉し、 デノボ miRNAの検出を可能にする。強力な次世代シーケンシング·プラットフォームとのカップリング、のmiR-配列は、miRNA生物学の研究に尽力してきました。しかし、オリゴヌクレオチドライゲーション手順によって導入の重要なバイアスが正確な定量ツールとして採用されてからは、miR-配列を妨げてきた。これまでの研究では、現在のmiR-のSeq法におけるバイアスはしばしばいくつかのmiRNA 1,2- 1,000倍までのエラーで不正確なmiRNA定量化につながることを実証している。 RNAライゲーションによって与えられるこれらのバイアスを解決するために、我々は両方の3 'および5'ライゲーションステップのため95％以上のライゲーション効率が得られる低分子RNAライゲーション法を開発した。このIMのベンチマーク一貫して期待値から2倍未満偏差の数値を読み取って得られ、等モルまたは差動で混合合成miRNAを使用してライブラリー構築法を証明した。さらに、この高効率のmiR-配列法は、 インビボでの総RNA試料2からの正確なゲノムワイドなmiRNAプロファイリングを可能にする。
Introduction
ハイスループットシークエンシングに基づく方法は、広く大きく、生物系3,4の分子の複雑さの理解を拡大近年、多くの生物学的サンプルに適用されている。しかし、ハイスループット配列決定のためのRNA試料の調製は、多くの場合、これらの強力な技術の潜在的な有用性を制限し、採用手法に固有の固有のバイアスを与える。これらの方法は、特定のバイアスは十分にライゲーションベースの、小RNAライブラリ調製物を1,2,5,6-ために文書化されている。これらのバイアスはがち乱暴変数と誤差シーケンシングデータからのmiRNAの存在量の推定を行う、等モル合成miRNAの番号を読み込み中1000倍のばらつきが生じる。
ファージ由来のT4 RNAリガーゼの特性に焦点を当てた研究では、酵素は、ハイスループットシークエンシング実験においてバイアスされたライブラリとして現れるヌクレオチドベースのプリファレンス7を示すことを報告している<s1,2,8>まで。 RNAリガーゼによって与えられるバイアスを最小にするために、多数の戦略が採用されてきた。高分子、9混雑ライゲーション部位6の近位にあるアダプタのヌクレオチド配列をランダム化し、ライゲーションアダプタ2の高濃度を用いる。これら三つのアプローチの組み合わせを通して、私たちは、ハイスループットシークエンシング（ 図1）のための互換性の低分子RNA図書館に関する調製するためのワークフローを開発しました。現在のプロトコルと私たちの最適化された方法との間の直接の比較のために、私たちの最近の報告書2を参照してください。この最適化された方法は、両方の3 'および5'のステップで95％より高いライゲーション効率が得られ、合成および生物学的試料2からの小RNA分子の公正な連結を可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書中に記載される方法論は、ライゲーション効率を最大化するためにいくつかの重要な変数の使用、すなわち、高いPEG濃度の、ランダム化されたリンカーの使用、およびリンカー2,6,9-高濃度になる。このアプローチは、総RNAサンプル2から確実に定量的なシーケンシングライブラリーを可能にする。我々は、入力されたRNAの複数の滴定を実施しており、先行する方法は1-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Referências
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