Высокоэффективная Лигирование малых РНК молекул для микроРНК количественного путем высокопроизводительного секвенирования
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Мирна клонирование и высокой пропускной последовательности, называется микроРНК-Seq, стоит особняком как транскриптома-широкий подход к количественной микроРНК с одной резолюции нуклеотидов. Эта техника захватывает микроРНК путем присоединения 3 'и 5' олигонуклеотидные адаптеры, чтобы молекул микроРНК и позволяет De Novo микроРНК открытие. Сцепление с мощными платформами для секвенирования следующего поколения, микроРНК-Посл играет важную роль в изучении микроРНК биологии. Тем не менее, значительные уклоны, введенные олигонуклеотидных шагов лигирования предотвратили Мир-Seq с должности работать как точный инструмент количественного. Предыдущие исследования показали, что перекосы в текущих микроРНК-Seq методов часто приводит к неточным микроРНК количественного с ошибками до 1000-кратного для некоторых микроРНК 1,2. Чтобы решить эти предубеждения придаваемых РНК перевязки, мы разработали небольшой РНК методом перевязки, что приводит к повышению эффективности перевязки более 95% как для 3 'и 5' шагов лигирования. Бенчмаркинг этот чатоказалась библиотека метод строительства с использованием эквимолярных или дифференциально смешанные синтетические микроРНК, последовательно дает считывает числа с менее чем в два раза отклонения от ожидаемого значения. Кроме того, этот высокоэффективный метод микроРНК-Посл позволяет точно генома микроРНК профилирования из в естественных условиях общего образцов РНК 2.
Introduction
Методологии, основанные высокопроизводительного секвенирования были широко применяется для многих биологических образцов в последние годы значительно расширяющих наши представления о молекулярной сложности биологических систем 3,4. Тем не менее, подготовка образцов РНК для высокопроизводительного секвенирования часто придает определенные предубеждения, присущие занятого методологии, ограничивающие потенциальную полезность этих мощных методов. Эти метод конкретных предубеждения были хорошо документированы для перевязки основе, малых РНК библиотечных препаратов 1,2,5,6. Эти предубеждения привести к изменению 1000 раз в считывает числа для эквимолярными синтетических микроРНК, делая вывод о микроРНК изобилия из данных секвенирования дико переменная и ошибок.
Исследования фокусировки от свойств фага Т4, полученных РНК лигазы документально, что ферменты обладают нуклеотидные на основе предпочтений 7, которые проявляются в виде смещенные библиотеки в высокой пропускной экспериментов секвенирования <sдо> 1,2,8. Для того чтобы свести к минимуму погрешностей придаваемых РНК лигазы, множественные стратегии были использованы; макромолекулярный скученности 9, рандомизации нуклеотидную на адаптере, который является ближайшим к лигирования сайта 6, и с использованием высоких концентраций лигирования адаптера 2. Благодаря сочетанию этих трех подходов мы разработали рабочий процесс для объективной подготовки небольших библиотек РНК совместимых для высокопроизводительного секвенирования (рисунок 1). Для прямых сравнений между текущими протоколами и наш оптимизированный метод, пожалуйста, обратитесь к нашему недавнему докладу 2. Это оптимизированный метод дает эффективность перевязки более чем 95% в обоих 3 'и 5' шагов и позволяет объективную перевязку малых молекул РНК из синтетических и биологических образцов 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методика описана в данном документе используется несколько ключевых переменных, чтобы максимизировать эффективность лигирования, а именно высокие концентрации PEG, использование линкеров рандомизированных и высокую концентрацию линкеров 2,6,9. Такой подход позволяет надежно кол…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Referências
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
