Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna clonación y secuenciación de alto rendimiento, denominado miR-Sec, destaca como un enfoque de todo el transcriptoma de cuantificar miRNAs con resolución de un solo nucleótido. Esta técnica captura miRNAs por fijar los adaptadores 3 'y 5' de oligonucleótidos a las moléculas de miARN y permite de novo miARN descubrimiento. El acoplamiento con potentes plataformas de secuenciación de próxima generación, el miR-Sec ha sido fundamental en el estudio de la biología de miRNA. Sin embargo, los sesgos significativos introducidos por pasos de ligación de oligonucleótidos han impedido que el miR-Sec de ser empleado como una herramienta de cuantificación exacta. Estudios previos demuestran que los sesgos en los métodos de miR-Seq actuales a menudo conducen a la cuantificación inexacta miARN con errores hasta 1.000 veces por algunos miRNAs 1,2. Para resolver estos sesgos impartidas por la ligadura de ARN, hemos desarrollado un pequeño método de ligadura de ARN que se traduce en eficiencias de ligación de más del 95% para ambos 3 'y 5' de ligación pasos. Evaluación comparativa de este improbado método de construcción de la biblioteca utilizando miRNAs sintéticos equimolares o diferencialmente mixtos, produce consistentemente lee los números con una desviación de menos de dos veces del valor esperado. Por otra parte, este método de gran eficacia miR-Sec permite precisa de todo el genoma de perfiles de miARN in vivo total de muestras de ARN 2.
Introduction
Metodologías basadas secuenciación de alto rendimiento han sido ampliamente aplicado a muchas muestras biológicas en los últimos años en expansión en gran medida nuestra comprensión de la complejidad molecular de los sistemas biológicos 3,4. Sin embargo, la preparación de muestras de ARN de secuenciación de alto rendimiento a menudo imparte sesgos específicos inherentes a la metodología empleada, lo que limita la utilidad potencial de estas técnicas de gran alcance. Estos sesgos de métodos específicos han sido bien documentados para las preparaciones de bibliotecas basado en la ligadura, pequeño-ARN 1,2,5,6. Estos sesgos como resultado la variación de 1.000 veces en lee los números de miRNAs sintéticos equimolares, hacer inferencia de miARN abundancia a partir de datos de secuenciación tremendamente variable y propenso a errores.
Estudios centrados en las propiedades de T4 ARN ligasas derivadas de fagos han documentado que las enzimas exhiben preferencias basadas en nucleótidos 7, que se manifiestan como bibliotecas sesgadas en experimentos de secuenciación de alto rendimiento <sarriba> 1,2,8. A fin de minimizar los sesgos impartidas por ARN ligasas, múltiples estrategias se han empleado; macromolecular crowding 9, la aleatorización de la secuencia de nucleótidos en el adaptador que es proximal al sitio de la ligadura de 6, y el empleo de altas concentraciones de adaptador de ligadura 2. A través de una combinación de estos tres enfoques, hemos desarrollado un flujo de trabajo para la preparación imparcial de pequeñas bibliotecas de ARN compatibles para la secuenciación de alto rendimiento (Figura 1). Para las comparaciones directas entre los protocolos actuales y nuestro método optimizado, por favor consulte nuestro informe reciente 2. Este método produce optimizado la eficiencia de ligación de más del 95% tanto en 3 'y 5' pasos y permite la ligadura imparcial de pequeñas moléculas de ARN de las muestras sintéticas y biológicas 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodología descrita en este documento hace uso de varias variables clave para maximizar la eficiencia de ligación, a saber, las altas concentraciones de PEG, el uso de enlazadores aleatorios, y alta concentración de enlazadores 2,6,9. Este enfoque permite a las bibliotecas de secuenciación de forma fiable cuantitativos de muestras de ARN total de 2. Hemos llevado a cabo múltiples titulaciones de ARN de entrada y han concluido que la metodología anterior es el más adecuado para las cantid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Referências
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