MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Mirna Klonierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung, genannt miR-Seq, steht allein als Transkriptom-weiten Ansatz für miRNAs mit Einzel-Nukleotid-Auflösung zu quantifizieren. Diese Technik nimmt miRNAs durch Anbringen 3 'und 5'-Oligonukleotid-Adapter zu miRNA-Moleküle und können de novo miRNA Entdeckung. Die Kopplung mit leistungsstarken nächsten Generation Sequenzierung Plattformen hat miR-Seq war maßgeblich an der Studie der miRNA Biologie. Allerdings haben erhebliche Verzerrungen durch Oligonukleotid-Ligation Schritte eingeleitet miR-Seq davor als eine genaue Quantifizierung Werkzeug eingesetzt verhindert. Frühere Studien zeigen, dass Vorurteile in aktuellen miR-Seq Methoden oft zu ungenauen miRNA Quantifizierung führen mit Fehlern bis zu 1.000-fach für einige miRNAs 1,2. Um diese Verzerrungen durch RNA-Ligation vermittelt zu lösen, haben wir ein kleines RNA Ligationsverfahren, die in Ligationsgrade von über 95% sowohl in 3 'und 5' Ligationsschritte ergibt entwickelt. Benchmarking diese imbewiesen Bibliothek Bauweise mit äquimolaren oder differentiell gemischten synthetischen miRNAs, konsequent ergibt liest Nummern mit weniger als zweifache Abweichung vom Erwartungswert. Darüber hinaus ermöglicht diese Hocheffizienz miR-Seq Methode genaue genomweiten miRNA Profiling von in vivo Gesamt-RNA-Proben 2.
Hochdurchsatz-Sequenzierung basierte Methoden sind weit verbreitet, viele biologische Proben in den letzten Jahren erheblich erweitern unser Verständnis der molekularen Komplexität biologischer Systeme 3,4 angewendet. Allerdings Vorbereitung RNA-Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung oft vermittelt spezifische Vorurteile inhärent angewandten Methode, die Begrenzung der potenziellen Nutzen dieser mächtigen Techniken. Diese Methode bestimmte Vorurteile sind gut für die Ligation-basierten, kleine RNA-Bibliothek Vorbereitungen 1,2,5,6 dokumentiert. Diese Vorspannungen ergeben 1.000-fache Variation liest Nummern äquimolaren synthetische miRNAs, wodurch Inferenz miRNA Fülle von Sequenzdaten wild variable und fehleranfällig.
Studien, die sich auf die Eigenschaften des Phagen T4 abgeleitetes RNA Ligasen haben dokumentiert, dass die Enzyme weisen Nucleotid-basierte Präferenzen 7, die als vorgespannte Bibliotheken in Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimenten manifestieren <sup> 1,2,8. Um die Vorspannungen von RNA Ligasen verliehen minimieren, verschiedene Strategien eingesetzt wurden; makromolekulare Verdrängung 9, Randomisierung der Nukleotidsequenz des Adapters, die proximal zu der Ligationsstelle 6 ist, und unter Verwendung hoher Konzentrationen von Ligations Adapter 2. Durch eine Kombination dieser drei Ansätze haben wir einen Arbeitsablauf für unvoreingenommene Herstellung von kleinen RNA-Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung (Abbildung 1) kompatibel entwickelt. Für direkte Vergleiche zwischen aktuellen Protokolle und unser optimiertes Verfahren entnehmen Sie bitte unserem aktuellen Bericht 2 beziehen. Diese optimierte Verfahren ergibt Ligationsgrade von mehr als 95% an beiden 3 'und 5' Schritte und ermöglicht die unvoreingenommene Ligation von kleinen RNA-Molekülen aus synthetischen und biologischen Proben 2.
Die hierin beschriebene Methode verwendet mehrere Schlüsselvariablen Ligationseffizienzen, nämlich hohe Konzentrationen an PEG, die Verwendung von randomisierten Linker und hohe Konzentration von Linkern 2,6,9 maximieren. Dieser Ansatz ermöglicht zuverlässig quantitative Sequenzierung Bibliotheken aus Gesamt-RNA-Proben 2. Wir haben mehrere Titrationen von Eingangs RNA durchgeführt und dabei festgestellt, dass die vorangehende Methodik eignet sich am besten für die Gesamt-RNA Mengen in der 1-8…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |