鉴定蛋白质相互作用的网站使用多肽阵列
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
蛋白 – 蛋白相互作用介导的大部分过程中的生物体的活细胞和控制的动态平衡。受损的蛋白质相互作用可导致疾病，使得蛋白相互作用重要的药物靶标。因此，这是理解这些相互作用在分子水平上非常重要。蛋白质相互作用所使用的各种技术，从细胞和生物化学测定以定量的生物物理测定法的研究，并且这些可被执行或者与全长蛋白，用蛋白质结构域或肽。肽作为优秀的工具来研究蛋白质相互作用，因为肽可以容易地合成，并允许针对特定的相互作用位点。多肽阵列使两种蛋白之间的相互作用位点的识别，以及筛选的靶蛋白结合用于治疗目的的肽。它们还允许高通量SAR的研究。对于识别的结合位点，一个typi的卡尔肽阵列通常包含部分地重叠，从所希望的靶蛋白的一种或多种伴侣蛋白的完整序列的10-20个残基的肽。筛选阵列对靶蛋白的结合揭示了结合肽，对应于在伴侣蛋白仅使用少量的蛋白质的结合位点，以容易和快速的方法。
在这篇文章中，我们描述了一个协议，用于筛选肽阵列映射的目标蛋白及其合作伙伴之间的互动网站。肽阵列是基于伴侣蛋白考虑到它们的二级结构的序列设计。在这个协议中使用的阵列制备了INTAVIS生物分析仪器Celluspots阵列。该阵列被阻断，以防止非特异性结合，然后与所研究的蛋白温育。使用抗体检测显示对应于该蛋白之间的特异性相互作用位点的结合的肽。
Introduction
蛋白 – 蛋白相互作用介导的大部分过程中的活细胞。受损的蛋白质相互作用可导致疾病，使得蛋白相互作用重要的药物靶标。因此，这是理解这些相互作用在分子水平上非常重要。蛋白质相互作用所使用的各种技术，从细胞和生物化学测定以定量的生物物理测定法的研究，并且这些可被执行或者与全长蛋白，用蛋白质结构域或肽。肽作为优秀的工具来研究蛋白质相互作用。这是因为肽可以容易地合成，并允许集中于特定的相互作用位点，一方面与多个蛋白质靶在另一方面1,2-以高通量方式进行。肽阵列筛选是一种快速，容易获得在短时间内3大量关于靶蛋白与许多伴侣的相互作用数据的执行方法。不像其他的生化或生物物理方法，用于检测和分析蛋白质 – 蛋白质相互作用，肽阵列筛选，需要非常低的蛋白质的浓度，并且可以检测到非常微弱的结合。肽阵列可用于多种应用中的肽-蛋白质相互作用，如蛋白-蛋白或受体-配体相互作用位点4，同源或异源寡聚化接口的映射，表征抗体的表位5，学习酶活6和高通量构筑物效关系（SAR）研究7。为深入审查有关肽阵列筛选看到卡茨等人 4
几种类型的肽阵列的当前存在的。有用于制备多肽阵列两大合成策略：合成肽它们附着于固相载体上的肽的，或合成直接在固体支持物上，主要是使用SPOT技术4,8-之前。该肽是由9-芴基（Fmoc）化学8在固体载体上合成通常。其中常见的合成方案是通过N端的肽连接（ 例如，JPT pepstar阵列9）和肽附着通过C末端（ 如 PEPSCAN pepchip阵列10，JPT pepspot阵列9和INTAVIS celluspot阵列11）4等。固体支持物可以有所不同，所以没有肽偶联到它的化学性质。半胱氨酸终止的肽可以通过硫醇基团12被连接到载玻片上。的N末端 的肽可以通过氨基酸的酯化共价结合到纤维素上的膜具有羟基附8。
这里，我们提出了详细的方案用于筛选肽阵列作为用于研究蛋白质 – 蛋白质相互作用的方法。我们所使用的阵列是Celluspots阵列，它是一种含有大摩在微阵列UNT通过载玻片支撑在一个小的纤维素膜的斑点（高达384点的重复）的。这使蛋白质的低量和抗体的工作，并取得显著量为每一次实验的数据。该阵列还包含高肽密度可以检测低亲和力结合。该阵列被用于映射STIL-CHFR相互作用，这是用于控制正常细胞的增殖13非常重要。这两种蛋白之间的不受控制的相互作用可以导致癌症的发展。通过映射这种互动，我们发现了特异结合位点，并结合残基14。这种铺平了道路设计能抑制这种蛋白质 – 蛋白质相互作用理性抑制剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
多肽阵列筛选是一个极好的工具，用于识别其合作伙伴靶蛋白的结合位点。该测定法是快速和容易地进行，其结果可以在一个或两个工作日内得到。肽阵列筛选是通用的，并且可以用于多种用途。它可以被用于表征交翻译修饰如磷酸化，并确定激酶的底物。例如：FLT3激酶，它与急性骨髓性白血病，磷酸化通过肽阵列筛选6发现含酪氨酸的肽底物。酪氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼和拉帕替尼的抑…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
房颤是由欧洲研究理事会的欧盟第七框架计划下，开始资助项目（FP7 / 2007-2013）/ ERC资助协议N°203413和密涅瓦中心生物混合复杂systems.HA和AI支持由达莉亚和丹公司Maydan奖学金为高级学位的学生在耶路撒冷的希伯来大学。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
Referências
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
