Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية والسيطرة التوازن الحية للكائن الحي. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين منذ الببتيدات يمكن تصنيعه بسهولة والسماح للتركيز على مواقع التفاعل محددة. صفائف الببتيد تمكن من تحديد مواقع التفاعل بين اثنين من البروتينات وكذلك الكشف عن الببتيدات التي تربط البروتين المستهدف لأغراض علاجية. أنها تسمح أيضا إنتاجية عالية دراسات ريال. لتحديد مواقع الربط، وtypiكال الببتيد عادة يحتوي على مجموعة متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات المستمدة من سلاسل كاملة من واحد أو أكثر من البروتينات شريك من البروتين الهدف المنشود. فحص مجموعة للربط البروتين المستهدف يكشف عن الببتيدات ملزمة، المقابلة لمواقع الربط في البروتينات شريك، في وسيلة سهلة وسريعة فقط باستخدام كمية صغيرة من البروتين.
في هذه المقالة وصفنا بروتوكولا لفحص صفائف الببتيد لرسم خرائط مواقع التفاعل بين البروتين المستهدفة وشركائها. تم تصميم مجموعة الببتيد على أساس تسلسل البروتينات شريك مع مراعاة الهياكل الثانوية الخاصة بهم. كانت المصفوفات المستخدمة في هذا البروتوكول صفائف Celluspots بواسطة INTAVIS الآلات Bioanalytical إعدادها. تم حظر مجموعة لمنع غير محددة ملزمة ثم حضنت مع البروتين دراستها. الكشف باستخدام الأجسام المضادة يكشف الببتيدات ملزم المقابلة لمواقع محددة تفاعل بين البروتينات.
البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية الحية. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين. هذا لأن الببتيدات يمكن توليفها بسهولة وتسمح بالتركيز على موقع التفاعل معين من جهة، وعلى أهداف متعددة في البروتين بطريقة إنتاجية عالية على الآخر 1،2 اليد. فحص مجموعة الببتيد هو سريعة وسهلة لأداء طريقة للحصول على كمية كبيرة من البيانات حول تفاعلات البروتين المستهدف مع العديد من الشركاء في وقت قصير 3. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية أو الفيزيائية الحيوية الأخرى لكشف وتحليل تفاعلات البروتين البروتين، وفحص مجموعة الببتيد يتطلب تركيز منخفض جدا من البروتين ويمكن الكشف ضعيفة جدا ملزمة. صفائف الببتيد يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات في التفاعلات الببتيد البروتين مثل رسم الخرائط من البروتين البروتين أو مواقع التفاعل مستقبلات يجند 4، واجهات هومو أو مغاير oligomerization، والأجسام المضادة التي تميز الحواتم 5، ودراسة الأنشطة الإنزيمية 6 وإنتاجية عالية بالهيكل علاقة النشاط (SAR) دراسات (7). لإجراء استعراض معمق حول فحص مجموعة الببتيد رؤية كاتز وآخرون. 4
عدة أنواع من المصفوفات الببتيد موجودة حاليا. هناك نوعان من الاستراتيجيات الصناعية الكبرى لجعل صفائف الببتيد: تركيب الببتيدات قبل إرفاقها إلى دعم قوي، أو تركيب الببتيدات مباشرة على دعم قوي، وذلك أساسا باستخدام 4،8 تقنية SPOT. الويتم تصنيعه الببتيدات على دعم قوي عادة بنسبة 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) كيمياء 8. بين مخططات الاصطناعية شيوعا هي مرفق الببتيد من خلال محطة N (على سبيل المثال، JPT صفائف pepstar 9) والتعلق الببتيد من خلال محطة C (على سبيل المثال، PEPSCAN صفائف pepchip 10، JPT صفائف pepspot 9 و INTAVIS صفائف celluspot 11) 4. الدعم القوي يمكن أن تختلف وهكذا يفعل كيمياء اقتران الببتيد إليها. يمكن تركيبها الببتيدات CYS لإنهاء الشرائح الزجاجية عبر مجموعة ثيول 12. وN محطة من الببتيد يمكن تساهميا منضما إلى مجموعة الهيدروكسيل على الغشاء السليلوز من خلال الأسترة من الأحماض الأمينية المرفقة 8.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة لفرز المصفوفات الببتيد كوسيلة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. مجموعة استخدمنا هي مجموعة Celluspots، وهي مجموعة صغيرة تحتوي على عمو كبيرالاتحاد الوطني للعمال من البقع (التكرارات تصل إلى 384 نقاط) على الغشاء السليلوز صغيرة تدعمها شريحة زجاجية. وهذا يتيح العمل مع كميات منخفضة من البروتين والأجسام المضادة والحصول على كمية كبيرة من البيانات في تجربة واحدة. يحتوي هذا مجموعة أيضا كثافة عالية الببتيد الذي يسمح الكشف عن انخفاض تقارب ملزمة. واستخدمت المصفوفة لرسم خرائط التفاعل STIL-CHFR، وهو أمر مهم للغاية للسيطرة تكاثر الخلايا العادية 13. تفاعل غير المنضبط بين اثنين من البروتينات يمكن أن يؤدي إلى تطور السرطان. عن طريق تعيين هذا التفاعل وجدنا موقع ملزم محدد والمخلفات 14 ملزمة. هذا يمهد الطريق لتصميم مثبطات العقلانية التي تحول دون هذا التفاعل البروتين البروتين.
الببتيد فحص مجموعة هو أداة ممتازة لتحديد مواقع الربط من البروتين المستهدف في شركائها. هذا الاختبار هو سريعة وسهلة لأداء ويمكن الحصول على النتائج في واحد أو يومين عمل. الببتيد فحص مجموعة هي متعددة ويمكن استخدامها لأغراض كثيرة. أنها يمكن أن تستخدم لوصف تعديلات ما بعد ا…
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم وأيد AF بمنحة بدءا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاق ERC غرانت N ° 203413 ومركز منيرفا لبيو الهجين systems.HA معقدة ومنظمة العفو الدولية بواسطة داليا ودان رشاف الزمالة لطلاب درجة متقدمة في الجامعة العبرية في القدس.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
LAS-3000 camera | FUJI film |