La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula y el control vivir homeostasis del organismo. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones de proteína ya que los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permitir que el centrarse en los sitios específicos de interacción. Arrays de péptidos permiten la identificación de los sitios de interacción entre dos proteínas, así como la detección de los péptidos que se unen a la proteína diana con fines terapéuticos. También permiten alto rendimiento estudios SAR. Para la identificación de sitios de unión, un tipificaCal matriz péptido por lo general contiene en parte superpuestos 10-20 residuos de péptidos derivados de las secuencias completas de una o más proteínas asociadas de la proteína diana deseada. La detección de la matriz para la unión de la proteína diana revela los péptidos de unión, que corresponden a los sitios de unión en las proteínas asociadas, en un método fácil y rápido usando sólo una pequeña cantidad de proteína.
En este artículo se describe un protocolo para la detección de arrays de péptidos para el mapeo de los sitios de interacción entre una proteína diana y sus socios. La matriz de péptido está diseñado sobre la base de las secuencias de las proteínas asociadas, teniendo en cuenta sus estructuras secundarias. Las matrices utilizadas en este protocolo fueron Celluspots matrices preparadas por Intavis Bioanalíticos Instruments. La matriz está bloqueado para evitar la unión no específica y después se incubaron con la proteína estudiada. Detección usando un anticuerpo revela los péptidos de unión correspondientes a los sitios específicos de interacción entre las proteínas.
Introduction
Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula viva. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones proteína. Esto es porque los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permiten que el centrarse en un sitio de interacción específica por un lado y en múltiples dianas proteicas en un alto rendimiento en el otro lado 1,2. Screening matriz péptido es un rápido, fácil de realizar método para obtener una gran cantidad de datos acerca de las interacciones de una proteína diana con numerosos asociados en un corto período de tiempo 3. A diferencia de otros métodos bioquímicos o biofísicos para detectar y analizar interacciones proteína-proteína, péptido matriz de cribado requiere una concentración muy baja de proteína y puede detectar una unión muy débil. Arrays de péptidos pueden utilizarse para muchas aplicaciones en las interacciones proteína-péptido como el mapeo de la proteína-proteína o sitios de interacción receptor-ligando 4, interfaces de homo o hetero-oligomerización, los anticuerpos que caracterizan epítopos 5, el estudio de las actividades enzimáticas 6 y de alto rendimiento estructura- relación actividad (SAR) estudia 7. Para una revisión en profundidad acerca de la detección matriz péptido ver Katz et al. 4
Actualmente, existen diversos tipos de matrices de péptidos. Hay dos principales estrategias sintéticas para la fabricación de matrices de péptidos: síntesis de los péptidos antes de adjuntarlos al soporte sólido, o síntesis de péptidos directamente sobre el soporte sólido, principalmente utilizando la técnica de 4,8 SPOT. Lalos péptidos se sintetizan en el soporte sólido por lo general por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) química 8. Entre los esquemas sintéticos comunes son el apego péptido a través del extremo N-terminal (por ejemplo, JPT matrices Pepstar 9) y el apego péptido a través de la terminal C (por ejemplo, PEPSCAN matrices pepchip 10, JPT matrices pepspot 9 y Intavis matrices celluspot 11) 4. El soporte sólido puede variar y también lo hace la química del acoplamiento de péptidos a la misma. Péptidos terminados en Cys pueden estar unidos a portaobjetos de vidrio a través del grupo tiol 12. El terminal N de un péptido puede estar unido covalentemente a un grupo hidroxilo en la membrana de celulosa a través de esterificación del ácido amino unido 8.
Aquí presentamos un protocolo detallado para el cribado de arrays de péptidos como un método para el estudio de interacciones proteína-proteína. La matriz que utilizamos es la matriz Celluspots, que es un micro-array que contiene gran amount de manchas (duplicados de hasta 384 puntos) sobre una membrana de celulosa pequeña apoyados por un portaobjetos de vidrio. Esto permite trabajar con bajos volúmenes de proteína y anticuerpos y la obtención de cantidad significativa de datos por solo experimento. Esta matriz también contiene péptidos de alta densidad que permite la detección de baja afinidad de unión. La matriz se utilizó para el mapeo de la interacción STIL-CHFR, que es altamente importante para el control de la proliferación celular normal 13. Interacción incontrolada entre las dos proteínas puede conducir al desarrollo de cáncer. Mediante la cartografía de esta interacción se encontró el sitio de unión específico y residuos 14 de unión. Esto allana el camino para el diseño de inhibidores racionales que inhiben esta interacción proteína-proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detección matriz péptido es una excelente herramienta para la identificación de los puntos de unión de una proteína diana en sus socios. Este ensayo es rápido y fácil de realizar y los resultados se pueden obtener en uno o dos días hábiles. Screening matriz péptido es versátil y se puede utilizar para muchos propósitos. Se puede utilizar para la caracterización de modificaciones posterior a la traducción tales como la fosforilación y la identificación de sustratos de quinasas. Por ejemplo: la quinasa FLT…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Son compatibles AF fue apoyado por una subvención a partir del Consejo Europeo de Investigación en virtud del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) / acuerdo de subvención del CEI n ° 203 413 y por el Centro Minerva de Bio-híbrido systems.HA complejo y AI por la Dalia y Dan Maydan de Becas para estudiantes de grado avanzados en la Universidad Hebrea de Jerusalén.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
Referências
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