CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Summary

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Abstract

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Introduction

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs^1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template⁴.

The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells⁵, has been recently adapted for mammalian genome engineering^2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique⁶. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively^7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout^10,11, large-scale genomic deletions^12–14, pooled library screening for gene discovery^15,16, genetic engineering of numerous model organisms^{10,11,17–21}, as well as gene therapy^22,23.

Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase¹². Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts⁷. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation¹². Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform²⁴. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant²⁵.

Protocol

1. CRISPR Tasarım Tasarım sgRNAs elle veya serbestçe kullanılabilir çevrimiçi araçlar 7 kullanıyorsanız. Uzak hedef siteleri (hedef dışı etkileri) den bölünme riskini azaltmak için aynı genomik eşleşmeleri veya yakın maçları minimize kılavuz dizileri belirlemenize yardımcı olması için bu araçları kullanın. Bu rehber sıralar, genomik tanıma yerinde bir "NGG" sekansı ("protospacer bitişik motifi" veya PAM), üst akışında bir 20-mer ("protospacer sırası") oluşur emin olun. Not: Şekil 1, genler ve kodlayıcı olmayan elemanları için mümkün olan silme stratejileri açıklamaktadır. Bir gen nakavt oluşturmak için, ekson içinde bulunan iki sgRNA fonksiyon kaybı hatta monoallelik silme klonları zenginleştirecektir. Bu mRNA transkripti (Şekil 1B) saçma kaynaklı çürümesine yol kare kaymalı mutasyonlar neden olabileceği silinmemiş alellerin 12 üzerinde oluşturulmuş indellerin, yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Kullanörnek fare PIM1 silinmek istenen (Tablo 1, Şekil 2A Mus musculus) için yönlendirir. NOT: Bu örnekte, sgRNA-A'nın protospacer dizisi ve PAM sgRNA-B protospacer dizisi ve PAM üst (Watson) iplik (Şekil 2A) üzerine düşerken alt (Crick) iplikçikteki düşmek olur. Bununla birlikte, DSB üst veya alt sarmalına protospacer dizisi / PAM göre yönelimine bağımsız ortaya çıkar. Her kılavuz dizisinin ters tamamlayıcısı (RC) belirler. Tablo 1, Tablo 2 de bulunan örnek PIM1 sgRNA tamamlayıcısı dizileri ters. Klonlama ve ifade amaçları için ek nükleotidlerin dahil olmak üzere her rehber ve ilişkili ters tamamlayıcı için 24- veya 25-mer oligoları edinin. NOT: Burada pSpCas9 (BB) plazmid (pX330) (Addgene plazmid kimliği 42230) kullanımını tartışmak. Bu plazmid, aynı anda izin verirsgRNA ve SpCas9, ancak ekspresyonu seçimine 7 belirteçleri içermez. Diğer yapılar, örneğin GFP ve puromisin gibi seçilebilir işaretleyiciler, sırasıyla, ya da birden çok sgRNAs tek plasmidden eksprese edilebilir olduğu yapılan içerir pX458 (addgene plazmid İD 48138) ya da pX459 (addgene plazmid numarası 48139) gibi, kullanılabilir. BbsI kısıtlama enzimi (Tablo 3) kullanılarak pX330 vektörü içine klonlamak için rehberin ters tamamlayıcı önce 20-mer kılavuzu dizisi ve "AAAC" önce "OAKK" ekleyin. 20-mer birinci pozisyonu OAKK dizisinden sonra bir G nükleotidin dahil edilmesi ile arttırılır pX330 vektörü U6 promoteri değil G. sgRNA sentezleme ise, OAKK dizisi sonra 20-mer önce bir G nükleotidi ekleme . Ters tamamlayıcı oligo 3 'ucunda bir Cı ekleme (örneğin, sgRNA-A Tablo 4'te). Elde edilen oligolar 25-mer oligolar olacaktır. Nasıl20-mer (protospacer dizisinin) ilk pozisyonu G eğer hiç, başka bir G katmayan (örn, sgRNA-B Tablo 4'te) ve ters tamamlayıcı oligo son konumuna C eklemeyin. Bu durumda, elde edilen oligolar 24-mer oligolar (Tablo 4) olur. 2. Tasarım Silme Eleme Astarlar ("Silme bant", 1 Rakamlar – 2) dizisi iç primerler Tasarımı bir set ("non-silme bandı") ve memba ve sgRNA bölünme siteleri mansap primerlerin başka bir dizi silinecek. Silme yokluğunda, "silme bandı" sık sık verimli yükseltmek için çok büyük. Tipik algılama sgRNA hedef yerinde küçük bir Indel etkilenen olmaz sağlamak için tahmin bölünme sitesinden astarları en az 100 bp kullanın. (Skar sgRNA c üretilen küçük indeller analiz için ek primerler dizaynamaçlanan silme olmadan leavage sitesi). Ileri bir çift kullanın ve (150 içinde – 350 bp) her sgRNA hedef site kuşatan primerler ters skar incelemek için sgRNA hedef siteyi yükseltmek için. Bu monoallelik eksiltme klonu, içinde silinmemiş aleli ayırt edilmesi için yararlı olabilir. Küçük delesyonlar için ("silme grubu" yine amplifiye edilebilir), boyut silme varlığında ya da yokluğunda uygun olup olmadığını belirlemek için bir agaroz jel üzerinde amplikonları gidermek. Bu yaklaşım için, aşama 2.1'de tanımlanan iç primerler ihmal edilebilir. 3. CRISPR Klonlama Tavlanması ve oligolar fosforile. GKD 2 O 100 uM'lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse oligolar 24- veya 25-mer tamamlay ters, 1.0 ul sgRNA (bkz: adım 1.4 100 mcM) 1.0 ul sgRNA 24- veya 25-mer, oligo: 10 ul reaksiyon her rehber karışımı ve ters tamamlayıcısı hazırlayınt, oligo, 1.0 ul 10x T4 ligasyon tamponu, 6.5 ul GKD 2 O ve 0.5 ul T4 Polinükleotid Kinazı (PNK) (10,000 U / ml) (100 uM adım 1.4). NOT: fosforillenmiş oligolar yerine sipariş edilebilir. Bu yaklaşım için, T4 PNK kullanımı atlanmıştır. Aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR tavlama: 30 dakika boyunca 37 ° C; 95 ° C 5 dakika süre ile ve daha sonra 5 ° C / dk'da 25 ° C'ye kadar rampa. GKD 2 O oligolar 1:10 seyreltin (örneğin, 1.0 ul 1 uM'lik bir konsantrasyon elde etmek için oligolar + 9.0 ul GKD 2 O tavlama). Golden Gate montaj klonlama stratejisi 26 kullanılarak pX330 içine ligatı tavlı oligolar. 50 ul reaksiyon karışımı hazırlayın: 100 ng dairesel pX330 vektör, 1.0 ul tavlanmış oligolar (1 uM, adım 3.1.4), 5.0 ul sınırlayıcı enzim tamponu (10x), 4.0 ul (20 U) BbsI sınır enzimi (5000 U / mi), 5,0 μL ATP (10 mM), 0.25 ul (5 ug), BSA (20 mg / ml), 0.375 ul (750 U), T4 DNA ligaz (2,000,000 U / ml), ve H2O 50 ul son hacim olması için. Gerekirse bu reaksiyon, daha küçük bir son hacme küçültülmüş olabilir. Aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR çalıştırmak örnekler döngüler, 1-20 (5 dakika için 37 ° C, 5 dakika için 20 ° C); Döngü 21 (20 dakika boyunca 80 ° C). Bu döngü koşulları tek bir reaksiyonda (adım 3.2) meydana sindirim ve bağlanması için izin verir. DH5a E. 10 ul Transform (- 3.2.2 3.2.1) reaksiyon 1 ul E. coli hücreleri. 100 ug / ml ampisilin içinde büyütülmüş ve 37 ° C 'de O / N inkübe bir lizojeni etsuyu (LB) agar plakası üzerine levha. 3 koloni ve mini-hazırlık kültürünü aşılamak – 2 seçin. Her numune için mini hazırlık yapın ve bir U6 promotör ileri primer kullanarak her koloniyi sırası: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Bu arepresentative dizileme primeri; Diğer yandan kuşatan primerleri kullanılabilir. Bir dizi-doğrulanmış koloni seçin ve bir maxi-hazırlık kültürünü aşılamak. Hazırlık boyutu gerekli DNA getiriye dayanan ölçekli olabilir. Her CRISPR / Cas9 yapı için maxi-hazırlık yapın. 4. İlgi Hücreleri içine CRISPRs transfecting NOT: Bu protokol elektroporasyon 27 ile CRISPR / Cas9 Plazmidlerin teslim içerir. Bu protokol, murine erythroieukemia (MEL) hücrelerinin, bir süspansiyon, bir hücre hattı için detaylı olarak tarif edilmektedir. her adımda kültür ortamı, MEL hücreleri için kullanılan% 2 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içermektedir. Bununla birlikte, CRISPR / Cas9 plasmidlerin geçici transfeksiyon başarı, her hücre türü için tercih edilen kültür koşulları ve transfeksiyon stratejileri kullanılarak çok sayıda hücre tiplerine adapte edilebilir. MEL hücreleri süspansiyon hücreleri, yapışan hücreler saat talimatlar ikenave de dahil edilmiştir. CRISPR çift başına 2 x 10 6 hücre vardır emin olun. Elektroporasyon çözeltisi 100 ul 2 x 10 6 hücre yeniden süspanse edin ve elektroporasyon küvetine ilave edin. Her CRISPR / Cas9 yapı (10 ug toplam) 5 mikrogram ekleyin. GFP tanımı yapısının 0.5 ug ekleyin. Bir elektro-sistemi kullanılarak bir 2 mm bir küvete 5 ms 250 volt ile elektroporasyona hücreleri. NOT: Alternatif olarak katyonik lipozom-tabanlı transfeksiyon gibi başka transfeksiyon yöntemi kullanın. Genom düzenleme başlamadan önce sağlam plazmid teslimini sağlamak için bir raportör yapı ile her hücre hattı için transfeksiyon koşullarını optimize. Hemen elektroporasyon sonra kültür ortamı, 1 ml olarak küvet çözeltinin aktarın. Hücre canlılığını artırmak için ortama elektroporasyon ve çözüm aktarılması arasındaki süreyi en aza indirmek. 72 saat – 24 ila 37 ° C – 30 C'de inkübe edilir. Genomu artırabilir 30 ° Cverim düzenleme, ancak 37 ° C kabul edilebilir. Transfekte edilmiş hücrelerin (FACS) 5. flöresanla aktive edilen hücre FACS tüpü içine, bir 50 um filtre üzerinden filtreleyerek FACS Hücrelerden hazırlayın. FACS CRISPR yüksek düzeyde alınan hücrelerin zenginleştirmek için GFP pozitif hücrelerin 3 ~ üst% sıralamak / Cas9 oluşturur. Tek tek ayırıcıyla 96 gözlü yuvarlak tabanlı plakalara veya 96 oyuklu yuvarlak dipli levha 30 hücre sınırlayıcı seyreltme kullanılarak plaka kriteri hücreleri. Önce güvenilir bir şekilde 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 30 hücreleri elde etmek için bu işlemi gerçekleştirmek için sınırlayıcı seyreltme kullanılan hücre tipi kaplama duruma getirin. Hücre kültür ortamı, oyuk başına 100 ul içerir. Kaplama değil kalan sıralanmış hücreler ("toplu") için, gelecekteki kaplama için hücrelerin yarısı dondurma. Tarama ve astar doğrulama için diğer yarısını Plate (adım 6). NOT: Bu protocol süspansiyon hücreleri için. Tek tek hücre elde edilen klonlar toplanır, düz tabanlı 96 oyuklu plakaya taşınır, böylece yapışık hücreler 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki ya da düşük bir konsantrasyonda 10 cm'lik bir tabak içinde, bireysel hücrelerin büyümesine ya. 7 gün klon 7 37 ° C'de inkübe izin – – 14 gün dökme hücreleri 3 ila 37 ° C'de inkübe edin. Bu kez kullanılan hücre hattının iki katına zamana bağlı olarak değişir. NOT: Bu inkübasyon süresi PCR ile amaçlanan silinmesi için genomik DNA (gDNA) tarama için yeterli hücre çoğalması (adımlarını 6.1 ve 7.1) için izin verir. konsantrasyon aştığında toplu hücreler yeteri kadar 100,000 hücre / ml ya da yapışık hücreler için ~ çoğaldı, hücreler,% 80 izdiham ulaşmıştır. klonlar yeterince ~ 2 mm çapında bir kez makroskopik görünür çoğaldı. 6. Primer Doğrulama ve CRISPR için tarama / Cas9-aracılı Silme DNA ekstraksiyon çözeltisi 50 ul ebeveyn ve toplu hücre pelletleri resuspending ebeveyn ve toplu sıralanmış hücrelerden gDNA ayırın. Not: hücre sayıları geniş bir kabul edilebilir olsa da, genel olarak, 100,000 hücre, DNA izolasyonu için kullanılmıştır. toplu sıralanmış hücreler sgRNA-A ve sgRNA-B maruz kalan bir poliklonal nüfusun oluşmaktadır (adım 5). Aşağıdaki PCR amacı primerleri doğrulamak ve amaçlanan genomik silme varlığını doğrulamak için. Thermocycler örnek çalıştırın ve aşağıdaki programı çalıştırmak: 65 ° C, 6 dakika için 98 ° C sıcaklıkta 2 dakika boyunca gDNA çıkartma özelliğine sahiptir. DNA konsantrasyonu ölçün. Not: adım 6.1 ve 6.2 DNA ekstraksiyonu için etkili bir yöntem varken, genomik DNA izolasyonu için bir yöntem, adım 6.3 PCR yapabilmek için kullanılabilir. 10 _ (10 ul 2x PCR karışımı, 0.5 ul ileri astar: Aşağıdaki bileşenler ile 20 ul PCR birleştirin6 M), 0.5 ul ters primer (10 uM), 50-100 ng gDNA ve 20 ul kadar H2O. Yukarıda adım 2'de tasarlanmış primerleri kullanın. Ayrı reaksiyonlarda "olmayan silme grubu" ve "silme bant" için PCR yürütün. Not: Çok sayıda polimerazlar Aşama 6.3 için de kullanılabilir. 10 dakika boyunca, 15 dakika boyunca 95 ° C (30 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 1 dakika için 72 ° C, 95 ° C) 35 döngü ve 72 ° C: aşağıdaki parametreler kullanılarak bir PCR başlat örnekleri . Toplu sıralanmış hücreler test dayalı tasarlanmış her primer çifti için PCR koşulları optimize. 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu kullanılarak 10 V / cm,% 2 agaroz jeli üzerinde örnekleri çalıştırın. Olmayan silinmesi ve silme bantları (Şekil 2) varlığı / yokluğu örnekleri inceleyin. Çoklama "silme" ve "non-silme" tek bir reaksiyonda PCR primer çiftleri düşünün. Çoğullama Optimizebir poliklonal nüfus bireysel klonlar tarama önce (yani, toplu hücreleri sıralanır). Bu silme ve non-silme amplikonlar kolayca çoğullama için bir agaroz jel üzerinde çözülmesi çok önemlidir. 7. Eleme CRISPR / Delesyonlar ve Klon Seçimi Cas9 Klonlar Süspansiyon hücreleri için, daha önce 150 ul bir son hacim için oyuk başına 50 ul hücre kültür ortamı ihtiva eden bir tek 96-yuvalı plakanın tüm klonlar aktarın. Bu, bir çok kanallı pipet adım 7'de adımların geri kalan kısmı için kullanılmak üzere izin vererek tarama kolaylaştırır. Her transfer 50 ul de çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 çukurlu bir PCR levhasına (her bir oyuğa 100 ul bırakarak). 5 dakika boyunca 400 xg'de Santrifüj PCR plaka ve bir lavabonun üzerinde PCR plaka hafifçe vurarak süpernatant kaldırmak. Oyuk ve tekrar süspansiyon başına DNA ekstraksiyon çözeltisinin 50 ul ekle. Süspansiyon hücreleri için 7.3 adıma devam edin. </li> Yapışık hücreler, aspirat medya için. Bir klon mevcut olan her bir kuyucuğa% 0.05 tripsin-EDTA 20 ul ekle. Medya 200 ul süspanse hücreleri. Pipet hücreleri ayırmak için karıştırın. Iki ayrı 96-gözlü düz tabanlı plakalarda her bir ul Levha 100. Klon büyümek ve silme işlemleri için her bir klon taranması için diğer levha kullanmak için izin vermek için, bir plaka tutun. 200 ul bir toplam hacimde her bir oyuğa ilave 100 ul ekle. Hücrelerin büyümesine izin 72 saat – 24 bekleyin. Aspire medya. 96-PCR plaka iyi, tekrar süspansiyon ve transfer başına 50 ul DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin. 7.3 adıma devam edin. Klonlardan gDNA ekstrakte edin. Thermocycler Örnek çalıştırın: 6 dakika boyunca 65 ° C ve 2 dakika gDNA elde etmek için 98 ° C. PCR primerleri, ve dökme hücrelerinde optimum reaksiyon koşulları aynı kullanarak her bir klon Ekran (adım 6). Klonlar iDEN seçinİstenen silinmesi ile saptandı ve büyüme için daha büyük bir levha ya da şişeye hareket eder. Bialelik Silme Klonların 8. Doğrulama Elde edilen klonlar karakterize başarılı bir nakavt doğrulamak için DNA doğru klonlar aynı zamanda RNA ve / veya protein seviyelerini değerlendirmek. Bir plasmid vektörüne (bir PCR klonlama kiti ile, örneğin,) amplikonları, DNA değerlendirmek, bir düzeltme okuması polimeraz ile bialelik silme klonlarından silme bantları amplifiye ve klonlanması için. DH5a E. plazmidi Dönüşümü İlgili bir antibiyotik ile LB agar kaplan üzerine coli hücreleri ve plaka. Birden koloniler, mini hazırlık her biri seçin ve her silme alel 28 karakterize etmek Sanger dizileme her klonu maruz – 30. Başlangıç ​​ekranında sonra silinmek üzere PCR testi tekrarlamak doğru klon seçilir ve sonuçların tekrarlanabilirliği kalmasını sağlar. RNA değerlendirmek için, gen RT-qPCR gerçekleştirmekİlgili gen 30,31 e ifadesi. Protein değerlendirmek için, ilgili protein 33 karşı bir antikor kullanılarak bir bağışıklık gerçekleştirir.

Representative Results

Bu deneyin amacı, MEL hücreleri pim1 silme oldu. Birden örtüşmeyen sgRNA çiftleri (yani, bağımsız protospacer dizileri) kullanılması hedef dışı etkileri (Şekil 1A) kontrol etmek için yararlı olabilir. Tutarlı fenotip birden fazla bağımsız protospacer dizileri tarafından paylaşılan ortak bir off-hedef etkisine karşı bir on-hedef etkisinden kaynaklandığı daha muhtemel olacaktır. Her bir çift benzersiz silme kesme üretimine neden olacaktır. (Yani, n, ~ 150 bp'lik daha az) birbirine yakın olduğunda, aynı tarama primerleri sgRNAs her bir grubu tarafından üretilen silme tespit etmek için kullanılabilir. Genomik silme geninin (Şekil 1B) göre çeşitli konumlarda sgRNA çiftleri kullanılarak genleri bozabilir. Örneğin, sgRNA çifti tüm gen vücudun silinmesi için bir gen kanadına olabilir; çifti frameshift indellerin yaratma potansiyeli olan, iki ekson içinde yer olabilir bile bir veya her iki alleles silinmez değil; veya çift bir özel izoformuna bozulmasını sağlamak için belirli bir ekson kanadına olabilir. PIM1 için kullanılan silme stratejisi, tüm gen vücudu, bir 8 kb silme (Şekil 2) silmek için sgRNAs yan tasarım oldu. Bu strateji, bağlı pim1 geninin nispeten küçük kısmen seçildi. Bu örnek alt (Crick) iplik üzerinde üst (Watson) iplik ve bir PAM üzerindeki bir PAM (yeşil) gösterir; Ancak, DSB üst veya alt sarmalına PAM dizisi yerelleştirme bağımsızdır. sgRNA çifti alt kolundaki üst şeridi üzerinde de hem PAM dizilerine sahip, ya da her biri olabilir. Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, iki sgRNA tasarlanmış pX330 sentezleme vektörü içine klonlanmış ve bir GFP raportör (Şekil 2A) ile birlikte elektroporasyon vasıtasıyla MEL hücreleri teslim edildi. GFP + hücrelerin üst% 3, iki gün sonrası elektroporasyon sıralanır ve sınırlayıcı seyreltme de klonal kaplanmıştır. EkranŞekil 2'de gösterildiği gibi, ing primerleri aşama 2'de tarif edildiği gibi tasarlanmış ve edildi. PCR koşulları ebeveyn MEL hücreleri ve "dökme" kriteri hücrelerinden izole gDNA kullanılarak optimum hale getirilir. 10 gün sonra kaplama, gDNA tüm klonlar izole edildi ve olmayan silme (ND) ve silme (D) amplikonlar kalıpları göre olmayan silme, monoallelik ve bialelik silme klonları tespit PCR yoluyla silinmesi için taranmıştır (Şekil 3) . Sigara silme klonları olmayan silme amplikon varlığını ve silme amplikonun eksikliğine sahip olarak tanımlanmıştır. Monoallelik klonlar olmayan silinmesi ve silme amplikonlarının hem varlığını sahip olarak tespit edilmiştir. Bialelik klonlar olmayan silme amplikon olmaması ve silme amplikon varlığını sahip olarak tanımlandı. Bu silme için, 400 klon tarandı 126 monoallelik silme klonları ve 32 bialelik silme işleminin tespit hangi iyon klonlar (o silme frekans silme boyutu 12 ile değişir unutmayın önemlidir). Bialelik silme klon seçildi ve ortam 8 ml tüpler taşınmıştır. Genişleme için 5 gün bırakıldıktan sonra, her bir klon bialelik silme ve silme amplikonlar tam silme (Şekil 2B) tespit etmek Sanger dizileme tabi tutuldu onaylamak için gDNA'sından PCR ile yeniden test edildi. Silme amplikonlarının içinde Heterojenite kusurlu Indel oluşturan NHEJ onarım yansıtır. Olguların çoğunluğunda indeller ortaya monoallelelic eksiltme klonu olmayan silme alel dizilenmesi, monoallelik ve bialelik silme klonları her ikisi de gerekli olduğu uygulamalar için önemli olabilir, hatta silinmemiş alel sık CRISPR / Cas9 tarafından düzenlendi olduğunu gösteren . RNA, bialelik bir silme klonları izole edilir ve (Şekil 4) pim1 ifade kaybı teyit etmek için RT-qPCR ile analiz edilmiştir. yolları "> Olası silme stratejilerinin Şekil 1. şematik. (A) genomik silmeler için iki örnek sgRNA çiftleri (sırasıyla, siyah ve turuncu gösterilmiştir). mavi oklar olmayan silme Amplikon'u tespit primerleri gösterir ve kırmızı oklar silme Amplikon'u tespit primerleri göstermektedir. sgRNA 17 pozisyonları ve 18 kırmızı ve mavi vurgulanır sgRNA Siteleri-A 1 / A 2 ve pozisyonları 17 arasında tahmin Cas9 bölünme gösteren kırmızı bir çizgi ile sgRNA-Siteleri-B 1 / B 2 mor ve turuncu vurgulanır ve 18. (B) CRISPR yönelik bölünmelerin dikey siyah çizgiler olarak gösterilmiştir. mavi oklar olmayan silme Amplikon'u tespit primerleri gösterir ve kırmızı oklar silme Amplikon'u tespit primerleri göstermektedir. görüntülemek için buraya tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonu. Şekil üretmek ve dizi silme olmayan silme allel de dahil olmak üzere pim1 silinmesini tespit 2. Stratejisi. PCR bazlı tarama stratejisi (A) şematik pim1 silme klonları tanımlamak için. Bir primer çifti silme (mavi oklar) ve bir primer çifti iç bulunduğu silme (kırmızı oklar) dış lokalize. sgRNA dizileri (protospacer dizileri) mor gösterilmiştir. Dikey kırmızı çizgiler pozisyonlarda 17 ve sgRNA dizisinin 18 arasında tahmin Cas9 bölünme gösterir. (B) Sanger dizileme sgRNA tanıma yerinde Indel oluşumunu ortaya koymaktadır. sgRNA dizileri yeşil, mor ve PAM dizileri gösterilmiştir. Silme olaylar shçizgi işaretleri ve eklemeler eşdeğer sayısına göre kendi mavi vurgulanır. Dikey kırmızı çizgiler pozisyonları 17 ve sgRNA ve 18 arasında., Bölünme siteyi tahmin göstermektedir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Şekil 3. Dışı silme, monoallelik ve bialelik klonlar belirlenmesi Temsilcisi jel. Her klon için, sol şeritte olmayan silme amplikon (mavi "ND") ve sağ şeritte temsil kırmızı silme amplikon ("D" temsil ). Tekli klonlar, noktalı çizgilerle ayrılır. Üç monoallelik silme klonları klonlar 5, 6, ve sıralama verileri de görüldüğü gibi 2. Üç bialelik silme klonları c silme bant klon 15, 17, ve 13 olarak yalnız 13 silme kavşakta büyük silmeleri nedeniyle küçük bir boyutu vardır. Bialelik silme klonlarında pim1 ifade Şekil 4. kaybı. Pim1 sentezleme RT-qPCR iki bialelik eksiltme klonu için hesaplanmıştır. ACt yöntemi – Veri 2 kullanarak GAPDH normalize edildi. Protospacer Sekans sgRNA-A 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' Tablo PIM1 silinmesi için iki sgRNA 1. 20-mer protospacer dizileri. 543 "> Protospacer Sekans ters tamamlayıcı sgRNA-A-rc 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tablo 1 iki sgRNA için protospacer dizilerinin Tablo 2. Ters tamamlayıcısı. Diziler sgRNA-A 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Tablo 3. Protospacer sekansları ve bunların tersine "OAKK" ve "AAAC" ile tamamlar BbsI sınırlandırıcı enzim kullanılarak pX330 vektörü içine klonlamak için ilave edildi. Diziler sgRNA-A 5'-CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-A-rc 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-rc 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' PX330 vektörü U6 promoterinden Tablo 4. sgRNA sentezleme OAKK dizisinden sonra ve daha önce G nükleotidin ilavesi ile arttırılır20-mer., Bir ekstra G nükleotidin eklenmesi ters tamamlayıcı oligo 3 'ucunda (örn sgRNA-A) C nükleotidin eklenmesini gerektirir. 20-mer (protospacer dizisi) birinci pozisyonunda zaten G nükleotidi olduğu, ancak, başka bir G eklemeye gerek yoktur (ör sgRNA-B) ve ters tamamlayıcı son konumuna C eklemeye gerek oligo.

Discussion

CRISPR / Cas9 sistem çeşitli boyutlarda genomik silme oluşturmak için kullanılabilir. Biz silme sıklığı amaçlanan silme boyutuna göre ters orantılı olarak değişir görülmektedir rağmen, rutin birden bialelik silinmiş klonları elde 100 kb varan 1 Mb silmeler ve silmeleri kurtarmak mümkün olmuştur. Bir hücre hattı, sırasıyla sokulması silmeleri verim kaybı gözlemlenmiştir. Bu strateji, bir çok gen ve elemanlar arasında birleştirici silme oluşturulması için kullanılabilir. bialelik silme klonları elde süreci bialelik silinmesi ¹² klonların istenen sayısını elde etmek için silme boyutuna göre ekranlı gereken klonların az sayıda tahmin edilerek hızlandırılmış olabilir.

olasılık dağılımına bialelik silinmesi yokluğu ile monoallelik silme elde yeteneği fonksiyonunun tamamen kaybı ile ilişkili hücre öldürücü gösterebilir. Düşük frequency veya yok silmeler zayıf transfeksiyon, verimsiz sgRNAs veya (nedeniyle bir pozitif kontrol eksikliği silinmesi için ekran PCR primerleri doğrulamak için) verimsiz PCR primerleri tarama dahil bir dizi senaryoyu yansıtıyor olabilir. GFP ⁺ hücreler transfeksiyon verimliliği (adım 5.2) için bir vekil olarak kullanılabilir, böylece, GFP ⁺ hücrelerinde bir azalma muhtemelen zayıf transfeksiyon yansıtır ve husule gelen silme etkinliği azalmıştır. Verimsiz sgRNA için kontrol yardımcı olabilir bağımsız tarama primerleri ile iki farklı sgRNA çiftleri kullanılarak ve PCR primerleri tarama ve bialelik silme klonları elde şansını maksimize. GFP ⁺ hücreler için sıralama Hücre silme allelleri için zenginleştirir. Bu adım, ihmal edilebilir olsa da, ihmal muhtemelen monoallelik veya bialelik silme olan tespit etmek daha fazla klonun taranması gerektirecektir. Transfeksiyon verimliliği optimize edilebilir olduğu ölçüde, biz genom düzenleme verimliliği gelişmiş olması beklenir.

<p ckız = "jove_content" hedef bölgelerde indellerin çeşitli alellerin bir dizi silme ve yerel onarım sonucunu altında yatan> NHEJ olaylar. 10 bp'lik girmeler ya da daha yaygın olarak sgRNA yönelik bölünme (Şekil 2B) yerinde kromozom anormallikleri – baskın sonuç küçük ~ 1. Genellikle bu aleller microhomology dayalı onarım ^34,35 sonucu gibi görünmektedir. Biz tarif PCR bazlı saptama stratejisi daha büyük veya daha karmaşık bir ekleme, delesyon, evirtme ve yeniden düzenlemeler tespit etmeyeceği hususu not edilmelidir. Bu olaylar daha az yaygın olmasına rağmen, biz ne silme ne de olmayan silme amplikonlar tespit edilebileceği klonları gözlenen ve daha fazla araştırma üzerine bu daha karmaşık sonuçlar yansıtmaktadır var.

Biz geniş CRISPR / monoallelik ve non-silme klonları olmayan silme allel "yara izi" Cas9-aracılı gözlemledik (Şekil 2B bakınız). Bu "izleri" oluşuristenen silme olmadan sgRNA bölünme yerinde üretilen küçük indeller (yani, sgRNAs A ve B arasındaki müdahalede segmentin silinmesi). Bu yara izleri genellikle sgRNA hedef tanıma kesme. Bu nedenle daha önce aynı sgRNAs kullanarak sgRNAs maruz kalan hücrelerde allellerini yeniden hedefleme dikkatli çağırıyorum. Benzersiz sgRNA kullanmak istiyorum bir daha başarılı yeniden hedefleme stratejisi önce "yaralı" tanıma sitelerinden farklı dizileri. Durumlarda sgRNAs bir çift (Şekil 1B, alt), çerçeve kayması alleller da silme yokluğunda üretilebilir egzonik dizileri algıladığında. Bu nedenle, monoallelik silme klonları nedeniyle alel ¹² olmayan silinmiş üzerine frameshift mutasyonların yüksek frekans kaybı fonksiyon-zenginleştirilmiş olabilir.

^{38 –} CRISPR / Cas9 sistemi ile Tek endişe hedef dışı etkileri, yani, istenmeyen sitelere ³⁶ de genomik değişiklik. Recent raporları 17 ile kısa kılavuz RNA'lar ileri sürmüşlerdir – 19 nükleotid CRISPR sıklığını azaltabilir / off-hedef etkilerini ³⁹ Cas9 tabanlı. Buna ek olarak, bir nickase hedef bölge başına iki kılavuz kullanılarak çift-çentikleme stratejisi hedef dışı etkiler ⁷ en aza DSBs oluşturmak için de kullanılabilir. Seçenek olarak ise, RNAi kullanılan stratejilere benzer biz örtüşmeyen protospacer dizileriyle sgRNAs farklı çiftlerinin hedef dışı bir potansiyele karşı gözlenen fenotipin üzerinde hedef CRISPR / Cas9 modifikasyonu sonucu olduğunu göstermek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir etkisi. Uygun bir yaklaşım, tarama primerler (adım 2), tek bir dizi çoklu sgRNA çifti (Şekil 1A) için de kullanılabilir, böylece en az iki bitişik, fakat örtüşmeyen sgRNA çiftleri tasarım olacaktır. Ayrıca, eksik dizisi ve / veya bozulmuş geni reintroducing bir silme hücre hattı tamamlayan arasında nedensel bir ilişki kanıtlamak olabilirBelirli bir genomik silme ve fenotip.

Hücresel model sistemler ile çalışan biyologlar için, RNAi fonksiyonel genomik için güçlü bir araç temsil etmiştir. ^{42 –} Ancak, bu yaklaşımın sınırlamalar hedef mRNA transkript düzeylerinde azalma eksik, aynı geni hedef bağımsız reaktiflerin etkisinin heterojenitesini ve tohum bazlı olmayan tohum etkileri ⁴⁰ olmak üzere bilinen off-hedef etkilerini dahil ettik. Genom düzenleme stratejileri bu endişelerin çoğu ele veriyorum ve muhtemel genetik pertürbasyon ^8,36,37 için heyecan verici, tamamlayıcı bir yaklaşım temsil eder. Ayrıca, genom düzenleme RNAi mümkün geleneksel hedeflemenin zor bir şekilde genetik elemanları kodlayıcı olmayan ²⁵ yaklaşır çalışması için izin verir. Biz üretmek ve zarar fonksiyon-alellerini karakterize için sağlam ve özel bir yöntemi olarak CRISPR / Cas9 tarafından genomik silme nesil teşvik.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201S
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)	New England Biolabs	M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
BSA, Molecular Biology Grade	New England Biolabs	B9000S
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)	New England Biolabs	R0539S
pSpCas9(BB) (pX330)	Addgene	42230
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
BTX ECM 830	Harvard Apparatus	45-0052
BTX Solution and 2mm Cuvettes	Harvard Apparatus	45-0803
pmaxGFP Plasmid	Lonza	VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution	Epicentre	QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit	Qiagen	203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Life Technologies	K2700-20