Live-beeldvorming van de<em> Drosophila</em> Pupal Eye
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Inherente processen van Drosophila pupal ontwikkeling kan verschuiven en vervormen het oog epitheel op manieren die individuele cel gedrag moeilijk te volgen tijdens live cell imaging maken. Deze werkwijzen omvatten: retinale rotatie celgroei en organismale beweging. Bovendien onregelmatigheden in de topologie van het epitheel, waaronder subtiele stoten en plooien vaak voorgesteld als de pop wordt voorbereid voor beeldvorming, maakt het moeilijk om in-focus afbeeldingen van meer dan enkele ommatidia verwerven één brandvlak. De workflow hier geschetste remedies deze kwesties, zodat u gemakkelijk de analyse van cellulaire processen tijdens Drosophila ontwikkeling pupal oog. Toepasselijk-gefaseerde poppen zijn opgesteld in een beeldvormend toestel dat gemakkelijk kan worden gemonteerd in de meeste laboratoria Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP pt GMR-GAL4 driven UAS-α-catenine: GFP gebruikt om celgrenzen visualiseren in het oog epitheel 1 -3. Na deconvolutie istoegepast op fluorescerende beelden die zijn vastgelegd op meerdere brandpuntsvlakken, zijn maximale projectie beelden gegenereerd voor elk tijdstip en verbeterde software voor fotobewerking. Alignment algoritmen worden gebruikt om snel stabiliseren overbodige beweging, waardoor individuele cel gedrag gemakkelijker te sporen.
Introduction
De verbinding Drosophila oog wordt gekenmerkt door de stereotiepe opstelling van de ~ 750 ommatidia gescheiden door een honingraat-rooster accessoire pigmentcellen 4,5. Deze pigment cellen worden gevormd door een gecoördineerde combinatie van gebeurtenissen: de lokale cel bewegingen, celgroei, veranderingen in cel vorm, en apoptose. Live-weergave van deze epitheel maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze gebeurtenissen in een fysiologisch relevante en onverstoord driedimensionale context te bestuderen.
In tegenstelling tot eerdere protocollen 6,7, de techniek geschetste bevat een efficiënte methode voor het stabiliseren van vreemde weefsels beweging die niet losgekoppeld van het belichtingsproces kan worden. Deze werkwijze verhoogt studies cel gedrag in de ontwikkeling Drosophila popstadium oog epitheel – een weefsel dat groeit, roteert en verplaatst de loop van beeldvorming. Naast de motion-stabilisatietechniek dehier beschreven zal nuttig zijn voor het bestuderen van cellen in andere contexten waarin vreemde beweging optreedt.
Om celgrenzen visualiseren het netvlies gebied Drosophila, werden transgene vliegen lijnen gegenereerd die expressie Ubi-DE-Cadherin: GFP pt UAS-α-catenine: GFP onder controle van de oog-specifieke driver GMR-GAL4 1-3. Het gebruik van twee GFP-gelabeld membraan markers maakt de visualisatie van celgrenzen lagere lichtintensiteit. Dit minimaliseert weefselschade en fotobleking bij herhaalde blootstelling aan hoge-energie-golflengtes, waardoor hogere framerate en film duur. Om de effectiviteit van RNAi transgenen, UAS-DCR-2 werd ook verwerkt in een tweede vlieg lijn 8 te verbeteren.
In een derde update eerdere protocollen wordt een eenvoudiger beeldvormend toestel dat gemakkelijk wordt gemonteerd in de meeste laboratoria beschreven. Dit apparaat voorkomt de eis om een gespecialiseerde beeldvorming r hebbenig gegenereerd door een universiteit 'werkplaats' of een soortgelijke dienst. Deze beeldvorming rig is vergelijkbaar met die gebruikt worden om het andere pupal weefsels 9,10.
Hier voorgesteld is een eenvoudig live cell imaging protocol dat kan worden gebruikt om het morfogenetische gebeurtenissen die bijdragen aan oog patroonvorming van ~ 17-42 uur na verpopping formatie (hr APF) direct beoordelen. Specifiek, dit protocol laat toe de gevolgen van het modificeren genexpressie tijdens popstadium ontwikkeling bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschrijving van wild-type ontwikkeling (hierboven) vormt de basis voor vergelijkingen van patroonvorming gebeurtenissen in RNAi of overexpressie genotypen. Vergelijkingen van live-ontwikkeling weefsel zijn van onschatbare waarde bij het nauwkeurig bepalen welke cel gedrag wordt gereguleerd door een eiwit van belang. Verder, en niet hier beschreven, live cell imaging maakt het mogelijk om kwalitatieve en / of kwantitatieve beschrijving van de functie van een gen van interesse maken de gebeurtenissen die patroon het o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
