Live-imagerie de la<em> Drosophila</em> Nymphe yeux
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Processus inhérents à la nymphose Drosophila peuvent changer et de fausser l'épithélium de l'oeil de manière à rendre le comportement de cellules individuelles difficiles à suivre lors de l'imagerie de cellules vivantes. Ces procédés comprennent: la rotation de la rétine, la croissance cellulaire et le mouvement organismal. En outre, des irrégularités dans la topologie de l'épithélium, y compris bosses subtiles et se replie souvent présentés comme la nymphe est préparé pour l'imagerie, font qu'il est difficile d'acquérir des images de mise au point de plus que quelques ommatidies dans un plan focal unique. Le workflow décrit ici remédie à ces questions, ce qui permet une analyse facile de processus cellulaires au cours du développement des pupes des yeux drosophile. Nymphes appropriée à étages sont disposés dans un appareil de formation d'image qui peut être facilement assemblé dans la plupart des laboratoires Ubiquitin-DE-Cadhérine. GFP et GMR-GAL4 axées sur l UAS-α-caténine: GFP sont utilisés pour visualiser les limites des cellules dans l'épithélium oculaire 1 -3. Après déconvolution estappliqué aux images fluorescentes capturées à plusieurs plans focaux, images maximales de projection sont générés pour chaque point de temps et améliorées en utilisant un logiciel de retouche d'image. Algorithmes d'alignement sont utilisés pour stabiliser rapidement le mouvement superflu, qui rend le comportement de cellules individuelles plus facile à suivre.
Introduction
Le composé de Drosophila yeux est caractérisée par la disposition de ses stéréotypé ~ 750 ommatidia séparés par un treillis en nid d'abeilles de cellules de pigment accessoire 4,5. Ces cellules pigmentaires sont modelés par une combinaison coordonnée d'événements: les mouvements de cellules locales, la croissance cellulaire, les changements dans la forme des cellules et l'apoptose. La visualisation en direct de cet épithélium permet d'étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces événements dans un contexte tridimensionnel physiologiquement pertinente et imperturbable.
Contrairement aux protocoles précédents 6,7, la technique décrite ici comprend un procédé efficace pour la stabilisation de mouvement de tissu étranger qui ne peut pas être désaccouplé du processus d'imagerie. Cette méthode améliore les études de comportement des cellules dans le développement de la drosophile épithélium pupe des yeux – un tissu qui se développe, tourne, et les changements au cours de l'imagerie. En outre, la technique de mouvement de stabilisationdécrit ici sera utile pour l'étude des cellules dans d'autres contextes où le mouvement se produit étrangère.
Pour visualiser les limites des cellules de la rétine dans le domaine de la drosophile, mouche lignes transgéniques ont été générés qui expriment ubi-DE-Cadherin: GFP ainsi que UAS-α-caténine: GFP sous le contrôle du pilote spécifique de l'oeil GMR-GAL4 3.1. L'utilisation de deux marqueurs membranaires GFP étiqueté permet la visualisation des limites des cellules à la lumière d'intensité plus faible. Cela minimise les dommages des tissus et photoblanchiment sur l'exposition répétée à des longueurs d'onde de haute énergie, permettant taux de trame augmenté et la durée du film. Pour améliorer l'efficacité de transgènes ARNi, UAS-DCR-2 a également été incorporé dans une deuxième ligne de mouche 8.
Dans une troisième mise à jour de protocoles précédents, une plate-forme d'imagerie simple qui est facile à assembler dans la plupart des laboratoires est décrite. Cet appareil permet d'éviter l'obligation d'avoir une imagerie spécialisée rig généré par 'la boutique de machine »d'une université ou d'un service similaire. Cette plate-forme d'imagerie est similaire à celle utilisée pour l'image d'autres tissus pupes 9,10.
Présenté ici est un protocole simple d'imagerie des cellules vivantes qui peut être utilisé pour évaluer directement les événements morphogénétiques qui contribuent à la structuration de l'œil de ~ 17 à 42 h après la formation du puparium (h APF). Plus précisément, ce protocole permet de déterminer les conséquences de la modification de l'expression des gènes au cours du développement de chrysalide.
Protocol
Representative Results
Discussion
La description du développement de type sauvage (ci-dessus) constitue la base pour les comparaisons d'événements de structuration dans ARNi ou des génotypes de surexpression. Les comparaisons de développement direct de tissu sont très précieux pour déterminer précisément quels comportements cellulaires sont réglementés par une protéine d'intérêt. En outre, et non décrit ici, imagerie des cellules vivantes permet de faire une des descriptions qualitatives et / ou quantitatives sur le rôle d'u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
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