のライブイメージング<em>ショウジョウバエ</em>蛹アイ
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
ショウジョウバエの蛹の開発の固有のプロセスがシフトし、生細胞イメージングの間に追跡する個々の細胞の挙動を困難にする方法で、眼の上皮を歪めることができます。これらのプロセスとしては、網膜回転、細胞増殖と生物の動きを。蛹は、それが困難な単一の焦点面で数個眼以上の焦点の合った画像を取得するために行う、画像化のために準備されるように加え、微妙なバンプとを含む上皮のトポロジにおける不規則性はしばしば導入襞。ワークフローは、ここにショウジョウバエの蛹の眼の開発中に細胞プロセスの容易な分析を可能に救済こ れらの問題を、説明した。適切ステージ蛹を簡単にほとんどの研究室で組み立てることができる撮像リグに配置されているユビキチンDEカドヘリン：GFPとGMR-GAL4駆動型UAS-αカテニン：GFPを眼の上皮1のセル境界を視覚化するために使用されている-3。デコンボリューションは、された後複数の焦点面において捕捉蛍光画像に適用し、最大値投影画像は、各時点で生成され、画像編集ソフトウェアを使用して強化される。アラインメントアルゴリズムを迅速に追跡するために、個々の細胞の挙動が容易になり、余分な動きを安定化させるために使用される。
Introduction
化合物ショウジョウバエの眼は、アクセサリ色素細胞4,5のハニカム格子で区切り、その〜750個眼のステレオタイプの配置によって特徴づけられる。ローカル細胞運動、細胞増殖、細胞形状の変化、及びアポトーシスこれらの色素細胞は、イベントの協調組み合わせによってパターニングされる。この上皮のライブ可視化は1つが生理学的に関連し、非摂動3次元コンテキストでこれらのイベントを支える分子機構を研究することができます。
以前のプロトコル6,7とは対照的に、ここで説明する技術は、イメージングプロセスから分離することができない無関係な組織の動きを安定化するための効率的な方法を組み込んでいる。 、成長回転し、画像化の過程でシフト組織-このメソッドは、開発ショウジョウバエの蛹のアイ上皮における細胞の挙動の研究を強化する。加えて、動き安定化技術デここにスクライブ余分な動きが発生した他のコンテキストで細胞を研究するために有用であろう。
アイ固有のドライバGMR-GAL4 1-3の制御下にGFP：GFPなどUAS-αカテニン：シ ョウジョウバエ網膜のフィールドにセル境界を視覚化するために、トランスジェニックハエラインはUBI-DEカドヘリン発現する生成した。 2 GFPタグ付きの膜マーカーの使用は、より低い強度の光でセル境界の視覚化を可能にする。これは、組織の損傷を最小限に抑え、高エネルギー波長に繰り返し暴露に退色増加フレームレート、動画継続を可能にする。 RNAiの導入遺伝子の有効性を高めるために、UAS-DCR-2は、第2フライライン8に組み込まれた。
以前のプロトコルから第三の更新では、簡単にほとんどの実験室で組み立てられた単純なイメージングリグについて説明する。この装置は、特殊なイメージングrを持つ必要性をなくす大学の「機械工場 'または類似のサービスによって生成されたIG。この結像リグ画像他蛹組織9,10に用いられるものと同様である。
ここで提示直接蛹殻形成（時間APF）後〜17から42時間の眼のパターニングに寄与形態形成事象を評価するために使用できる単純な生細胞イメージングプロトコルである。具体的には、このプロトコルは、蛹の開発中に遺伝子発現を改変する結果を決定するために、1つを可能にする。
Protocol
Representative Results
Discussion
野生型開発（上記）の説明は、RNAiパターニングイベントまたは過剰発現遺伝子型の比較のための基礎を形成する。正確に決定する際に生きている組織の発達の比較は、細胞の挙動、目的のタンパク質によって調節される非常に貴重である。さらに、ここでは説明しない、生細胞イメージングは1つが、そのパターンの目のイベントに関心のある遺伝子の役割の定性的および/または定量的?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
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