Vivo-imaging da<em> Drosophila</em> Pupal Eye
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Processos inerentes de Drosophila desenvolvimento pupal pode mudar e distorcer o epitélio olho nas maneiras que fazem comportamento célula individual difícil de controlar durante imagens de células vivas. Estes processos incluem: rotação da retina, crescimento celular e movimento do organismo. Além disso, as irregularidades na topologia do epitélio, incluindo colisões sutis e dobras muitas vezes apresentado como o pupa é preparado para a imagem latente, fazer-se um desafio para adquirir imagens com foco de mais do que alguns ommatidia em um único plano focal. O fluxo de trabalho descrito aqui remédios esses problemas, permitindo uma fácil análise de processos celulares durante Drosophila desenvolvimento pupal olho. Apropriadamente pupas-staged estão dispostos em uma plataforma de imagiologia que podem ser facilmente montados na maioria dos laboratórios de Ubiquitina-DE-caderina:. GFP e GMR-GAL4 UAS -driven-α-catenina: GFP são utilizados para visualizar os limites da célula no epitélio do olho 1 -3. Após deconvolution éaplicado a imagens fluorescentes capturados em múltiplos planos focais, as imagens de projecção máximos são gerados para cada ponto de tempo e aumentada utilizando software de edição de imagem. Algoritmos de alinhamento são usados para estabilizar rapidamente movimento supérfluo, fazendo com que o comportamento das células individuais mais fácil de controlar.
Introduction
O composto do olho de Drosophila é caracterizada por a disposição dos seus estereotipado ~ 750 ommatidia separadas por um favo de mel-reticulado de células de pigmento acessório 4,5. Estas células de pigmento são modeladas por uma combinação coordenada de eventos: movimentos locais de células, crescimento de células, alterações na forma da célula, e a apoptose. Visualização vivo deste epitélio permite estudar os mecanismos moleculares subjacentes a esses acontecimentos num contexto tridimensional fisiologicamente relevante e não perturbada.
Em contraste com os protocolos anteriores 6,7, a técnica descrita aqui incorpora um método eficiente para estabilizar o movimento tecidos estranhos que não pode ser desacoplado do processo de imagiologia. Este método aumenta a estudos de comportamento de células no desenvolvimento de Drosophila epitélio pupa olho – um tecido que cresce, gira, e deslocamentos ao longo da imagem. Além disso, a estabilização de movimento técnica dedescrito aqui será útil para estudar as células em outros contextos em que ocorre o movimento estranho.
Para visualizar os limites das células no campo de retina de Drosophila, mosca linhas transgénicas foram geradas que expressam ubi-DE-caderina: GFP, bem como UAS-α-catenina: GFP sob o controlo do controlador do olho GMR-GAL4 específico 1-3. A utilização de dois marcadores de membrana GFP permite a visualização de limites da célula com menor intensidade de luz. Isso minimiza o dano tecidual e fotodegradação na exposição repetida a comprimentos de onda de alta energia, permitindo uma maior taxa de quadros e duração do filme. Para melhorar a eficácia de transgenes RNAi, UAS-DCR-2 também foi incorporada uma segunda linha de fly 8.
Numa terceira actualização de protocolos anteriores, um equipamento de imagem simples que pode ser facilmente montado na maioria dos laboratórios é descrito. Este aparelho elimina a exigência de ter uma imagem r especializadaig gerado por uma universidade "máquina shop 'ou serviço similar. Este equipamento de imagem é semelhante ao utilizado para a imagem de outros tecidos pupa 9,10.
É apresentado aqui um protocolo de imagens ao vivo de células simples que pode ser usado para avaliar directamente os eventos morfogenéticas que contribuem para a modelação do olho de ~ 17 e 42 horas após a formação pupário (hr APF). Especificamente, este protocolo permite que se determinar as conseqüências de modificar a expressão de genes durante o desenvolvimento de pupa.
Protocol
Representative Results
Discussion
A descrição de desenvolvimento do tipo selvagem (acima) constitui a base para a comparação de padrões de eventos em RNAi ou genótipos superexpressão. Comparações de desenvolvimento do tecido vivo são de valor inestimável para determinar precisamente quais os comportamentos celulares são regulados por uma proteína de interesse. Além disso, e não descrita aqui, imagem de células vivas permite que se faça descrições qualitativas e / ou quantitativas da função de um gene de interesse em que os eventos p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
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