Live-proyección de imagen de la<em> Drosophila</em> Pupal Ojo
Summary
This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.
Abstract
Procesos inherentes al desarrollo de pupa Drosophila pueden cambiar y distorsionar el epitelio del ojo de manera que tengan el comportamiento de células individuales difíciles de rastrear durante imágenes de células vivas. Estos procesos incluyen: la rotación de la retina, el crecimiento celular y el movimiento del organismo. Además, las irregularidades en la topología del epitelio, incluyendo golpes sutiles y se pliega a menudo presentados como la pupa se prepara para la imagen, hacen que sea difícil de adquirir imágenes en foco de más de unos pocos ommatidia en un solo plano focal. El flujo de trabajo describe aquí remedios estos temas, lo que permite un fácil análisis de procesos celulares durante el desarrollo del ojo Drosophila pupa. Pupas adecuadamente organizado, están dispuestos en una plataforma de imágenes que se pueden montar fácilmente en la mayoría de los laboratorios de la ubiquitina-DE-cadherina:. GFP y GMR-GAL4 impulsada UAS-α-catenina: GFP se utilizan para visualizar los límites celulares en el epitelio del ojo 1 -3. Después de deconvolución esaplicado a las imágenes fluorescentes capturados en múltiples planos focales, las imágenes de proyección máxima se generan para cada punto de tiempo y mejorar el uso de software de edición de imágenes. Algoritmos de alineación se utilizan para estabilizar rápidamente el movimiento superfluo, haciendo que el comportamiento célula individual más fáciles de seguir.
Introduction
El compuesto Drosophila ojo se caracteriza por la disposición de sus estereotipada ~ 750 ommatidia separadas por un panal de celosía de las células de pigmento de accesorios 4,5. Estas células pigmentarias se modelan mediante una combinación coordinada de eventos: los movimientos celulares locales, el crecimiento celular, los cambios en la forma celular y la apoptosis. La visualización en directo de este epitelio permite estudiar los mecanismos moleculares que sustentan estos eventos en un contexto tridimensional fisiológicamente relevante e imperturbable.
En contraste con los protocolos anteriores 6,7, la técnica descrita aquí incorpora un método eficaz para estabilizar el movimiento tejido extraño que no puede ser desacoplado del proceso de formación de imágenes. Este método mejora estudios de comportamiento de las células en el desarrollo de Drosophila epitelio ojo pupal – un tejido que crece, gira, y los cambios en el curso de formación de imágenes. Además, el movimiento de estabilización técnica dedescrito aquí será de gran utilidad para el estudio de las células en otros contextos donde se produce el movimiento extraño.
Para visualizar límites de las celdas en el campo de la retina Drosophila, líneas de moscas transgénicas se generaron que expresan ubi-DE-cadherina: GFP, así como UAS-α-catenina: GFP bajo el control del controlador de ojos específica GMR-GAL4 1-3. El uso de dos marcadores de membrana GFP-etiquetados permite la visualización de límites de las celdas en la luz de menor intensidad. Esto minimiza el daño tisular y photobleaching en la exposición repetida a longitudes de onda de alta energía, lo que permite una mayor velocidad de fotogramas y la duración de la película. Para mejorar la eficacia de los transgenes RNAi, UAS-DCR-2 también se incorporaron a una segunda línea de la mosca 8.
En una tercera actualización de los protocolos anteriores, un equipo de formación de imágenes más simple que se monta fácilmente en la mayoría de los laboratorios se describe. Este aparato evita la necesidad de tener una imagen especializada rig genera de una universidad 'tienda de máquina o un servicio similar. Este aparejo de formación de imágenes es similar a la utilizada para otros tejidos imagen pupal 9,10.
Se presenta aquí es un simple protocolo de imágenes de células vivas que se puede utilizar para evaluar directamente los eventos morfogenéticos que contribuyen a modelar el ojo del ~ 17 a 42 horas después de la formación pupario (hr APF). En concreto, este protocolo permite a uno para determinar las consecuencias de la modificación de la expresión génica durante el desarrollo pupal.
Protocol
Representative Results
Discussion
La descripción del desarrollo de tipo salvaje (arriba) forma la base para las comparaciones de eventos patrones en RNAi o genotipos sobreexpresión. Las comparaciones de desarrollo de tejido vivo son muy valiosos para determinar con precisión qué comportamientos celulares están regulados por una proteína de interés. Además, y no se describe aquí, imágenes de células vivas permite a uno hacer descripciones cualitativas y / o cuantitativas de la función de un gen de interés en los eventos que el patrón del oj…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe | ||
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems | ||
Referências
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