在 MyD88的介导的细胞免疫应答西尼罗河病毒变异株感染体外分析
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
减毒西尼罗河病毒（WNV），非结构（NS）的4B-P38G突变，诱发较高先天细胞因子和T细胞应答比野生型WNV小鼠。近日，髓样分化因子88（MyD88的）信号被证明在WNV NS4B-P38G突变感染是初始T细胞吸和记忆性T细胞的发育很重要。在这项研究中，2流式细胞术为基础的方法- 在体外的T细胞引发测定和胞内细胞因子染色（ICS） -被用于评估树突细胞（DC）和T细胞的功能。标记OTII转基因小鼠的CD4 + T细胞-在T细胞吸试验中，细胞增殖通过流式细胞仪从两组小鼠羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）的下列DC的共培养物进行分析。这种方法提供了一种准确测定增殖的CD4 + T细胞的百分比与显著改进比传统的整体灵敏度人检测放射性试剂。微量离心管系统被用来在ICS协议的细胞培养和细胞因子染色程序。相较于传统的组织培养板为基础的系统，这个修改过程是比较容易在生物安全水平（BL）3设施进行。此外，WNV-感染的细胞与多聚甲醛在两种测定中，这使BL3设施以外进一步分析处理。总之，这些体外免疫学测定法可以用来有效地评估WNV感染期间细胞介导的免疫反应。
Introduction
西尼罗河病毒（WNV），神经营养，加黄病毒检测到，是一个新兴的公共健康威胁。目前，还没有疫苗已被批准供人类使用1。减毒WNV菌株，其具有P38G取代的非结构（NS）蛋白4B，被称为诱导小鼠没有杀伤力但较高先天细胞因子和T细胞应答的小鼠比野生型WNV NY99菌株2。免疫小鼠的NS4B-P38G突变均免受致命野生型WNV次要挑战。这表明，NS4B-P38G突变体具有合适特征的理想的候选疫苗。通过该NS4B-P38G突变导致的高保护性免疫机制尚不清楚呢。 toll样受体（TLR），其识别病原体相关分子模式，发挥在先天免疫病毒感染的启动中起重要作用。核心TLR信号通路利用骨髓分化初级反应GENE 88（MyD88的）作为主适配器3,4。在最近的一项研究中，MyD88信号被证明在小鼠5 WNV NS4B- P38G突变感染在细胞介导的免疫发展具有重要作用。树突状细胞（DC）是最重要的抗原呈递细胞表现出病毒感染6,7中以引发初级T细胞反应的独特能力之一。 CD4 +和CD8 + T-细胞既有助于长期的保护性免疫，并且下面的野生型WNV感染8,9-重要寄宿存活。两种免疫测定法在本研究中使用，以评估这些细胞在NS4B-P38G突变感染的小鼠的功能。
首先， 在体外 T细胞吸测定用于比较的DC西尼罗病毒感染的野生型和MyD88的的抗原呈递能力– / –小鼠。为了提高检测，天真CD4 <灵敏度SUP> + T细胞从OTII的转基因小鼠，其表达Vα2/Vβ5TCR特异性鸡卵白蛋白（OVA）肽323分离- 339.议会西尼罗病毒感染小鼠进行纯化，并共培养以羧基琥珀酰亚胺复活节（CFSE ）标记的CD4 + T细胞在OVA肽存在下进行。经过5天共培养，收获细胞并固定用多聚甲醛（PFA）和通过流式细胞术分析。增殖测定法已被传统上进行的，通过将5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记或氚化胸腺嘧啶脱氧核苷（3 HTdr）10掺入。然而，这些测定是要么放射性和/或需要在生物安全等级（BL）的3设施，其中，西尼罗病毒的研究进行的专用设备。的淋巴细胞增殖的活体染料CFSE标记已经变得更加普遍的免疫学测定法中使用的荧光强度的串行减半的流式细胞仪分析的染料更稳定地并均匀地掺入到细胞中，用流式细胞容易检测仪，并且非放射性11。该测定法还具有以评估细胞分裂的数目的能力。使用这种测定法中的WNV研究的一个主要优点是，感染的细胞以1-2％的PFA的固定可以灭活西尼罗病毒12，这将使样品采集在一个BL2实验室流式细胞仪。
接着，经修饰的细胞内细胞因子染色（ICS）的步骤，用于研究的MyD88的信令中的WNV特异性T细胞应答调节NS4B-P38G突变感染的小鼠中的作用。在该测定中，脾细胞从感染小鼠分离的处理在体外用WNV特异性肽。布雷菲德菌素A加入到保持在细胞内的细胞因子。后5小时温育后，收获细胞，洗涤并染色T细胞亚群。然后将细胞固定在PFA，透化染色对干扰素（IFN）-γ和通过流式细胞术分析。与其他术为基础的流测定，一旦细胞被用固定和含有PFA透化缓冲液处理过的，被感染的样品可以被转移到一个BL2实验室用于进一步处理和分析。在一些发表的研究中，我们使用的ICS测量在WNV感染的小鼠13,14的T细胞的效应子功能。虽然它的确定无疑的，此测定中的一个主要缺点是，该过程是非常冗长并且可能是更多的时间内BL3设施执行时费时。这里，微离心管系的ICS方法被证明是更可行的，更容易进行，以及更短的时间时内BL3实验室进行耗时。
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV是BL3病原体。由于安全法规，免疫学检测与WNV感染的样本通常是由设备的可用性BL3设施或者更加漫长和繁琐的进行限制。在最近的研究中，我们使用了两种流式细胞仪为基础的方法西尼罗病毒感染5时，研究细胞介导的免疫反应。在这两个试验中，西尼罗病毒感染的细胞用直接或用含有4％PFA固定/透化溶液1-2％的PFA。众所周知，病毒感染的细胞的1％PFA中固定可有效降低到低于检测限1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
Referências
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