In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

Resumo

Dois métodos baseados em citometria de fluxo - um ensaio de priming de células T in vitro e coloração de citocinas intracelulares foram utilizados para medir a capacidade de apresentação de antígenos de células dendríticas e respostas de células T específicas do antígeno a uma infecção mutante pelo vírus do Nilo Ocidental em camundongos.

Resumo

Um vírus atenuado do Nilo Ocidental (WNV), um não-estrutural (NS) 4B-P38G mutante, citocina induzida maior inata e respostas de células T do que o de tipo selvagem em ratinhos WNV. Recentemente, factor de diferenciação mielóide 88 (MyD88) de sinalização foi mostrado ser importante para o escorvamento inicial das células T e o desenvolvimento de células T de memória durante a infecção mutante WNV NS4B-P38G. Neste estudo, dois fluir métodos baseados em citometria - in vitro de células T e um ensaio de priming citocina coloração intracelular (ICS) - foram utilizados para avaliar as células dendríticas (DC) e funções de células T. Na célula T priming ensaio, a proliferação celular foi analisada por citometria de fluxo após a co-cultura de DC a partir de ambos os grupos de ratinhos com éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) - rotulados células T CD4 ⁺ de ratinhos transgénicos OTII. Esta abordagem proporcionou uma determinação exacta da percentagem de proliferação de células T CD4 ⁺ com melhorou significativamente a sensibilidade global do que a tradiçãoai ensaia com reagentes radioactivos. Um sistema de tubo de microcentrifugadora foi utilizado em ambos os procedimentos de cultura de células e de coloração de citocinas do protocolo ICS. Comparado com o tradicional sistema baseado em placa de cultura de tecido, este procedimento modificado foi mais fácil para se apresentar no nível de biossegurança (BL) 3 instalações. Além disso, as células infectadas foram tratadas com WNV- paraformaldeído em ambos os ensaios, o que permitiu uma análise mais aprofundada fora das unidades de BL3. Em geral, estes ensaios imunológicos in vitro pode ser utilizado para avaliar a eficiência mediada por respostas imunes celulares durante infecção WNV.

Introdução

Vírus do Nilo Ocidental (WNV), um neurotrópico, plus-sensoriamento flavivírus, é uma ameaça emergente de saúde pública. Actualmente, não há vacinas foram aprovados para uso humano ^1. Uma estirpe atenuada WNV, o qual possui uma substituição no P38G não estrutural (NS) da proteína 4B, é conhecida por induzir sem letalidade em ratinhos mas citocinas maior inatas e respostas de células T em ratinhos de tipo selvagem do que o WNV NY99 estirpe ^2. Os ratinhos imunizados com o mutante NS4B-P38G foram todos protegidos a partir de um desafio letal com secundária de tipo selvagem WNV. Isto sugere que o mutante de NS4B-P38G tem características apropriadas p....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Texas Medical Branch.

1. Isolamento de DCs de não-infectados e infectados pelo WNV Mice

1. Idade e sexo partida 6-10 semanas de idade, do tipo selvagem C57BL / 6 (B6) e MyD88 ^{- / -} ratos. Inocular por via intraperitoneal (ip) com 500 placas formando unidade (UFP) de WNV NS4B- P38G mutante. No dia 3 de pós-infecção, eutanásia MyD88 B6 e ^{- / -} ratos com CO _2. Use camundongos não infectados de ambos os grupos como controles. Use três murganhos de cada grupo.
2. Pele molhada no lado esquerdo do rato sacrificados....

Resultados

No ensaio de células T de escorva, as células T CD4 ⁺ foram cultivadas CFSE rotulados com DCs purificadas a partir do tipo selvagem NS4B-P38G infectadas com mutante e MyD88 ^{- / -} ratos na presença ou ausência de péptidos OVA. As células T cultivadas marcadas por si só, com ou sem OVA durante 5 dias, foram utilizadas como controlos negativos. Como mostrado na Figura 1A, as células T totais foram fechado para a análise da intensidade de fluorescência no canal FL1. O marcador foi cria.......

Discussão

WNV é um patógeno BL3. Devido às normas de segurança, testes imunológicos com amostras infectadas com WNV muitas vezes são limitadas pela disponibilidade de equipamentos no BL3 instalações ou mais longo e tedioso para executar. Em um recente estudo, foram utilizados dois métodos baseados em citometria de fluxo para estudar as respostas imunes mediadas por células durante a infecção WNV ^5. Em ambos os ensaios, as células infectadas com WNV foram tratados com 1-2% PFA directamente ou com uma solução de fixação .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI 1640	Invitrogen	11875	aquece a 37 &graus; C
grânulos magnéticos anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	seguem o fabricante s instruções
anti-CD4 contas magnéticas	Miltenyi Biotec	130-095-248	siga o fabricante' s instruções
CFSE	Invitrogen	C34554
Resíduo OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptídeos	Proimune	PC0AD-D
Brefeldin A solução	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	conjugado com APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 conjugado com FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Solução de Fixação/Permeabilização	BD-Bioscience	554722
Permeabilização/tampão de lavagem	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Citômetro de fluxo Accuri	BD Biociência