Her præsenterer vi en protokol, der tillader investigator at vurdere leukocytrekruttering dynamik ex vivo ved at forbinde et kammer belagt med endotel-afledt adhæsionsmolekyler til kredsløbssystemet på en mus. Denne metode giver betydelige fordele, da det giver mulighed for leukocyt vurdering efter relative biologiske forhold.
Leukocyt-endotel interaktioner er tidlige og kritiske hændelser i akut og kronisk inflammation og kan, når dysreguleret, mægle vævsskade, der fører til varig patologisk skade. Eksisterende konventionelle assays tillader analyse af leukocytadhæsion molekyler efter udvinding af leukocytter fra blodet. Dette kræver blodet underkastes flere trin før perifere blodleukocytter (PBL'er) kan være klar til analyse, hvilket kan stimulere PBL'er der påvirker forskningsresultater. Den autoperfused micro flow kammer assay, tillader imidlertid forskerne at studere tidlige leukocytter funktionelle dysregulering ved hjælp af den systemiske strøm af en levende mus samtidig have frihed manipulere en belagt kammer. Gennem en sygdom model kan den funktionelle ekspression af leukocytadhæsion molekyler vurderes og kvantificeres i en mikro-glas kammer overtrukket med immobiliserede endotel adhæsionsmolekyler ex vivo. I denne model, strømmer blodetmellem den højre, fælles carotidarterie og venstre ydre halsvene af en levende mus under anæstesi, så interaktionen af native PBL'er i kammeret. Real-time eksperimentel analyse opnås med hjælp fra en intravital mikroskop samt en Harvard Apparatus tryk enhed. Anvendelsen af en flowregulator på input punkt i glaskammer giver sammenlignelige fysiologiske strømningsforhold blandt forsøgene. Leukocyt rullende hastighed er det vigtigste resultat, og måles ved anvendelse af National Institutes of Health åben adgang software ImageJ. Sammenfattende autoperfused micro strømningskammer analysen giver et optimalt fysiologisk miljø at studere leukocytter endotel interaktion og giver forskerne til at drage præcise konklusioner, når man studerer inflammation.
Inflammation er kroppens universelle reaktion på skade og er et afgørende skridt i både medfødte og adaptive immunsystem funktion. Som reaktion på skade og / eller inflammatoriske stimuli, endotelceller opregulere specifikke adhæsionsmolekyler; dette fører til leukocyt ekstravasation gennem det mikrovaskulære endotel, primært i post-kapillære venuler. Denne proces begynder med tethering af fritflydende leukocytter i blodet på endotel. Stabil rullende og fast vedhæftning af leukocytter, hvilket igen fører til sjælevandring og udskillelsen af cytostatika, følge denne tethering 1,2. Selectiner er kendt for at mediere de tidlige trin i kaskaden 3-5; integriner er ansvarlige for de senere trin i fast adhæsion og transmigration 1,6-8.
Stadig flere beviser tyder leukocytter og endotel adhæsionsmolekyler har afgørende roller i dyremodeller af iskæmisk reperfusionsbeskadigelse, Astma, psoriasis, dissemineret sklerose, og aldersrelateret makuladegeneration 9-12. Under disse betingelser er den inflammatoriske reaktion misdirected at angribe ens egen krop, hvilket resulterer i nedbrydning af sundt væv. Eksisterende antiinflammatoriske midler (såsom ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler, kortikosteroider eller andre kemoterapeutiske midler) bærer risikoen for alvorlige bivirkninger med langvarig brug 13. Det er derfor af stor interesse at have de nødvendige værktøjer med evnen til at identificere sygdomsspecifikke molekyler, som i sidste ende kan målrettes til at have den ønskede anti-inflammatorisk virkning, mens de resterende ikke-toksisk 14.
Eksisterende in vitro-metoder, såsom den statiske leukocytadhæsion assay blev anvendt så tidligt som 1976 15. Den parallelle strømning Kammeret blev først anvendes in vitro i 1987 for at studere leukocyt-endotel-interaktioner under strømningsforhold. I disse forsøg stimulerede human polymorfkernede leukocytter (PMN'er) fra veneblod blev perfunderet i et monolag af primære humane navleveneendotelceller (HUVEC'er). For at kontrollere for de hæmodynamiske strømningsforhold blev Harvard Apparatus sprøjtepumpen ansat 16. Alternativt, for at undgå kunstig leukocytter isolation blev fuldblod anvendes i kombination med glasset kammer overtrukket med immobiliserede adhæsionsmolekyler 17.
For at undgå leukocyt stimulation og mekanistisk studere deres interaktion med adhæsionsmolekylerne under omtrentlige fysiologiske betingelser, en ex vivo autoperfused, ekstrakorporal, arteriovenøs kredsløb blev udviklet 16. I dette kredsløb, blodet strømmer mellem den højre, fælles carotidarterie og venstre ydre halsvene af en levende mus under anæstesi, så interaktion native PBL'er inden et glas Microflow kammer overtrukket med enkelt eller co-immobiliserede adhæsionsmolekyler. En stor fordel for denne system er evnen til at anvende genetisk manipulerede mus, hvor inflammatoriske veje er direkte eller indirekte manipuleret. Derudover er der mulighed for at lokalisere den isolerede bidrag leukocytadhæsion molekyler til inflammation, fri for ekstern aktivering under strømningsforhold. Anvendelsen af en flowregulator på input punkt strømningskammeret giver en bred vifte af eksperimentelle variationer af forskydningskræfter til at efterligne enten arteriel eller venøs systemer 18-22. Her beskriver vi i detaljer en protokol om forberedelse og udførelse af ex vivo autoperfused Microflow kammer assay.
Processen med leukocytrekruttering er et afgørende skridt i den inflammatoriske respons; det indebærer migration af leukocytter fra kredsløbet mod målvæv, hvor de er i stand til at udøve deres effektorfunktion. Leukocytrekruttering er integreret i en række inflammatoriske tilstande, såsom atherosklerotiske plaques, myokardieinfarkt, iskæmi / reperfusion og transplantation surgery 1, samt flere CNS-relaterede neuro-inflammatoriske tilstande 10-12,20,24,25. Baggrund af de forskelligartede betingelser sygdom, leukocytrekruttering spænd, den autoperfused Microflow kammer yder et uundværligt redskab, der giver undersøgeren mulighed for at studere leukocytmigration dynamik.
I løbet af de sidste mange årtier har en række forskellige in vitro assays er udviklet til at studere dynamikken i leukocyt celleadhæsion 26. Desværre alle disse assays kræver udvinding afleukocytterne fra blodet, indføre mekanisk aktivering. For at komme tættere på in vivo miljø blev tilpasninger foretaget for at indsamle fuldblodsprøver og kontrollere hæmodynamisk strømningsforhold 16,17. Her vi udvider de tidligere fremskridt inden for området ved at koble et overtrukket kammer til musen kredsløbssygdomme. Vi er i stand til at regulere strømmen af blod til en fysiologisk interval og studere dynamikken i leukocytrulning. Den coatede kammer giver os mulighed for at studere leukocyt interaktioner med specifikke adhæsionsmolekyler. Da systemet fungerer som en enhed, der drives af en levende mus, det mere nøje efterligner det naturlige miljø, tillader os at studere leukocyt-endotel-interaktioner i en række immunologiske musemodeller. Derudover dette system giver os mulighed for at drage fordel af de mange genetiske musemodeller rådighed. Mens systemet ikke helt replikere in vivo miljø, det giver en platform til at studere specific elementer af leukocytterne under fysiologiske betingelser, en præstation, der ikke tidligere har været muligt. Selvom det tager os et skridt tættere på en mere fysiologisk miljø der er begrænsninger for systemet. Det er ikke helt kopiere den komplekse 3D-matrix af karrene, så vi er kun i stand til at vurdere visse elementer af leukocyt interaktioner, der er begrænset til kammeret belægning. Desuden bør man være meget omhyggelig med at sikre et lukket system til musen cirkulation ved at følge alle trinene nævnt i protokollen. Indførelsen af luftbobler i høj grad vil påvirke nøjagtigheden og reproducerbarheden af forsøgene.
Mens vi beskriver anvendelsen af Autoperfused Microflow kammer til vurdering leukocytrulning dynamik proceduren har potentialet til at være personlig af forskere til at studere en række sygdomme. For eksempel kræftceller metastaserer ved at udtrykke mange af de almindelige integrinerne deles af leukocytter. Studying deres rullende dynamik i en indstilling, der i højere grad efterligner et in vivo miljø kunne bidrage til vores viden, og eventuelt forudsigelsen af den invasive art af visse kræftceller. En mulig fremgangsmåde kunne være at kombinere en mærkning teknik til cancerceller, såsom GFP 27, sammen med strømningskammeret assay til at spore rullende dynamik cancercellerne udtrykker GFP. I lyset af fleksibiliteten belægge kammeret med en række stoffer og forbinde flere kamre til den samme mus, vil det være interessant at se, hvordan denne procedure er modificeret til brug i andre laboratorier i kombination med genetisk modificerede mus og sygdomsmodeller. Teknikken vi beskriver her blot berører et meget bredere potentiale, er kun begrænset af kreativitet investigator ansøgningen.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Eye Institute of National Institutes of Health under tildeling numre: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) og P30EY014104. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Yderligere støtte blev leveret af Massachusetts Lions Eye Research Fund (KMC) og en særlig Scholar Award fra forskning til at forhindre Blindness (til KMC).
Material | Vendor | Part number |
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
T tube | value plastics | T410-6 |
Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
35mm petri dish | Corning | 430165 |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
Fine forceps | FST | 11253-25 |
Fine scissors | FST | 15000-08 |
Tube holder | FST | 00608-11 |
Clamp applicator | FST | 18057-14 |
Vascular clamp | FST | 18055-04 |
6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
25x1G needles | BD | 305125 |
30×1/2G needles | BD | 305106 |
Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |