यहाँ, हम अन्वेषक एक माउस की संचार प्रणाली को एन्दोथेलिअल व्युत्पन्न आसंजन अणुओं के साथ लेपित एक कक्ष को जोड़ने के द्वारा ल्युकोसैट भर्ती गतिशीलता पूर्व vivo का आकलन करने की अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह रिश्तेदार जैविक शर्तों के तहत ल्युकोसैट आकलन के लिए अनुमति देता है के बाद से इस पद्धति का महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है।
ल्युकोसैट endothelial बातचीत तीव्र और जीर्ण सूजन में जल्दी और महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं और, dysregulated जब, स्थायी रोग क्षति के लिए अग्रणी ऊतक चोट मध्यस्थता कर सकते हैं। मौजूदा पारंपरिक assays के ही खून से leukocytes की निकासी के बाद ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के विश्लेषण अनुमति देते हैं। इस परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स (PBLs) बदले में अनुसंधान के निष्कर्षों को प्रभावित करने PBLs प्रोत्साहित कर सकते हैं, जो विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता से पहले कई चरणों से गुजरना करने के लिए रक्त की आवश्यकता है। autoperfused सूक्ष्म प्रवाह चैम्बर परख, हालांकि, वैज्ञानिकों ने एक लेपित चैम्बर जोड़ तोड़ की स्वतंत्रता होने जबकि एक लाइव माउस के प्रणालीगत प्रवाह का उपयोग कर कार्यात्मक अनियंत्रण जल्दी ल्यूकोसाइट्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। एक रोग मॉडल के माध्यम से, ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के कार्यात्मक अभिव्यक्ति का आकलन किया जा सकता है और स्थिर endothelial आसंजन अणुओं पूर्व vivo के साथ लेपित एक माइक्रो गिलास कक्ष में मात्रा निर्धारित। इस मॉडल में, खून बहता हैचेंबर में देशी PBLs की बातचीत की अनुमति सही आम मन्या धमनी और संज्ञाहरण के तहत एक जीवित माउस के बाएं बाहरी गले नस के बीच। वास्तविक समय प्रयोगात्मक विश्लेषण एक intravital माइक्रोस्कोप की सहायता के रूप में अच्छी तरह से एक हार्वर्ड उपकरण दबाव डिवाइस के साथ हासिल की है। कांच चैम्बर के इनपुट बिंदु पर एक प्रवाह नियामक के आवेदन के प्रयोगों के बीच तुलनीय शारीरिक प्रवाह की स्थिति की अनुमति देता है। ल्युकोसैट रोलिंग वेग मुख्य नतीजा है और स्वास्थ्य खुले उपयोग सॉफ्टवेयर ImageJ के राष्ट्रीय संस्थानों का उपयोग कर मापा जाता है। सारांश में, autoperfused सूक्ष्म प्रवाह चैम्बर परख ल्यूकोसाइट्स एन्दोथेलिअल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम शारीरिक वातावरण प्रदान करता है और सूजन का अध्ययन जब शोधकर्ताओं ने सटीक निष्कर्ष आकर्षित करने की अनुमति देता है।
शोथ चोट करने के लिए शरीर की सार्वभौमिक प्रतिक्रिया है और दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह में एक महत्वपूर्ण कदम है। चोट और / या भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में, endothelial कोशिकाओं विशिष्ट आसंजन अणुओं upregulate; यह मुख्य रूप से पद केशिका venules में, माइक्रोवैस्कुलर अन्तःचूचुक के माध्यम से परिस्त्राव ल्युकोसैट की ओर जाता है। इस प्रक्रिया अन्तःचूचुक पर खून में मुक्त बह leukocytes के लिए tethering के साथ शुरू होता है। स्थिर रोलिंग और बदले में स्थानांतरगमन और साइटोटोक्सिक एजेंटों का स्राव होता है, जो ल्यूकोसाइट्स की फर्म आसंजन, इस 1,2 tethering का पालन करें। Selectins झरना 3-5 के प्रारंभिक चरणों में मध्यस्थता करने के लिए जाना जाता है; integrins फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन 1,6-8 के बाद के चरणों के लिए जिम्मेदार हैं।
सबूत के एक बढ़ती शरीर ischemia के reperfusion की चोट के पशु मॉडल में leukocytes और endothelial आसंजन अणुओं है महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है, अस्थमा, सोरायसिस, एकाधिक काठिन्य, और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 9-12। इन शर्तों के तहत, भड़काऊ प्रतिक्रिया स्वस्थ ऊतकों का टूटना, जिसके परिणामस्वरूप एक ही शरीर पर हमला करने misdirected है। (जैसे गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं, corticosteroids के, या अन्य एजेंटों के रूप में) मौजूदा विरोधी भड़काऊ एजेंट लंबी अवधि के उपयोग 13 से गंभीर साइड इफेक्ट का जोखिम ले। इसलिए, यह गैर विषैले 14 जबकि शेष अंततः वांछित विरोधी भड़काऊ प्रभाव है लक्षित किया जा सकता है, जो रोग विशिष्ट अणुओं की पहचान करने की क्षमता है, साथ उपयुक्त उपकरण है करने के लिए महान ब्याज की है।
ऐसे स्थिर ल्युकोसैट आसंजन परख के रूप में इन विट्रो तरीकों में मौजूदा रूप में जल्दी 1976 15 के रूप में इस्तेमाल कर रहे थे। समानांतर प्रवाह चैम्बर पहले प्रवाह शर्तों के तहत ल्युकोसैट endothelial बातचीत का अध्ययन करने के लिए 1987 में इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया था। इन प्रयोगों में, हुमा प्रेरितएन शिरापरक रक्त से polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs) प्राथमिक मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) की एक monolayer अधिक perfused थे। Hemodynamic प्रवाह की स्थिति के लिए नियंत्रित करने के लिए, हार्वर्ड उपकरण सिरिंज पंप 16 नियोजित किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कृत्रिम ल्यूकोसाइट्स अलगाव से बचने के लिए, पूरे रक्त स्थिर आसंजन अणुओं 17 के साथ लेपित गिलास चैम्बर के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था।
ल्युकोसैट उत्तेजना से बचने के लिए और mechanistically अनुमानित शारीरिक शर्तों के तहत आसंजन अणुओं के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए, एक पूर्व vivo autoperfused, extracorporal, धमनी-सर्किट में 16 विकसित किया गया था। इस सर्किट में, रक्त एकल या सह immobilized आसंजन अणुओं के साथ लेपित एक गिलास microflow कक्ष के भीतर देशी PBLs की बातचीत की अनुमति, संज्ञाहरण के तहत एक जीवित माउस का अधिकार आम मन्या धमनी और बाएं बाहरी गले नस के बीच बहती है। इस syste को एक प्रमुख लाभएम भड़काऊ रास्ते सीधे या परोक्ष रूप से छेड़छाड़ कर रहे हैं, जिसमें अनुवांशिक इंजीनियर चूहों, रोजगार करने की क्षमता है। इसके अतिरिक्त, प्रवाह शर्तों के तहत, बाहरी सक्रियण से मुक्त सूजन के लिए ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के अलग योगदान तुच्छ करने की क्षमता नहीं है। प्रवाह चैम्बर के इनपुट बिंदु पर एक प्रवाह नियामक के आवेदन धमनी या शिरा प्रणालियों 18-22 या तो नकल करने कतरनी बलों की प्रयोगात्मक बदलाव की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है। यहाँ हम महान विस्तार में पूर्व vivo autoperfused microflow चैम्बर परख की तैयारी और प्रदर्शन के विषय में एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
ल्युकोसैट भर्ती की प्रक्रिया भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है; यह है कि वे अपने प्रेरक समारोह लागू करने में सक्षम हैं, जहां लक्ष्य ऊतकों की ओर संचार प्रणाली से leukocytes के प्रवास शामिल है। ल्युकोसैट भर्ती ऐसे atherosclerotic सजीले टुकड़े, रोधगलन, ischemia / reperfusion, और प्रत्यारोपण शल्य चिकित्सा के एक है, साथ ही कई सीएनएस संबंधित न्यूरो भड़काऊ शर्तों 10-12,20,24,25 के रूप में भड़काऊ स्थितियों की एक किस्म में अभिन्न अंग है। ल्युकोसैट भर्ती फैला, autoperfused microflow चैम्बर अन्वेषक ल्युकोसैट प्रवास गतिशीलता का अध्ययन करने की क्षमता की अनुमति के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करता है कि बीमारी की स्थिति की विविधता को ध्यान में रखते हुए।
पिछले कई दशकों में, इन विट्रो assays की एक किस्म ल्युकोसैट सेल आसंजन 26 की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। दुर्भाग्य से, इन assays के सभी की निकासी की आवश्यकता होती हैखून से ल्यूकोसाइट्स, यांत्रिक सक्रियण शुरू। Vivo में पर्यावरण के लिए करीब पाने के लिए, रूपांतरों पूरे रक्त के नमूने लेने और hemodynamic प्रवाह की स्थिति 16,17 नियंत्रित करने के लिए किए गए थे। यहाँ, हम माउस संचार प्रणाली के लिए एक लेपित चैम्बर जोड़ने के द्वारा क्षेत्र में पिछले अग्रिमों का विस्तार। हम एक शारीरिक श्रृंखला के लिए रक्त के प्रवाह को विनियमित करने और ल्युकोसैट रोलिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने में सक्षम हैं। लेपित चैम्बर हमें विशिष्ट आसंजन अणुओं के साथ ल्युकोसैट बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता देता है। प्रणाली एक लाइव माउस द्वारा संचालित एक इकाई के रूप में कार्य कर रहा है के बाद से, यह और अधिक बारीकी से हमें immunologic माउस मॉडल की एक किस्म में ल्युकोसैट endothelial बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, प्राकृतिक वातावरण mimics। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली हमें उपलब्ध कई आनुवंशिक माउस मॉडल का लाभ लेने के लिए अनुमति देता है। प्रणाली पूरी तरह से vivo वातावरण में नकल नहीं करता है, यह specifi के अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता हैशारीरिक शर्तों के तहत leukocytes के सी तत्वों, जो पहले संभव नहीं किया गया है कि एक करतब। इस एक कदम और करीब एक अधिक शारीरिक पर्यावरण के लिए हमें लगता है कि भले ही व्यवस्था करने के लिए सीमाएं हैं। हम चैम्बर कोटिंग करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं कि ल्युकोसैट बातचीत के कुछ तत्वों का आकलन करने में सक्षम हैं, तो यह पूरी तरह से vasculature की जटिल 3 डी मैट्रिक्स नकल नहीं करता है। इसके अलावा, महान देखभाल प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी चरणों का पालन करके माउस संचलन के लिए एक बंद व्यवस्था सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। हवा के बुलबुले की शुरूआत काफी प्रयोगों की सटीकता और reproducibility को प्रभावित करेगा।
हम ल्युकोसैट रोलिंग गतिशीलता का आकलन करने के लिए Autoperfused Microflow चैंबर के उपयोग का वर्णन जबकि प्रक्रिया रोगों की एक किस्म का अध्ययन करने के जांचकर्ताओं द्वारा व्यक्तिगत होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, कैंसर की कोशिकाओं को ल्यूकोसाइट्स द्वारा साझा आम integrins के कई व्यक्त metastasize। पढ़ाईजी अधिक बारीकी से हमारे ज्ञान में मदद कर सकता है एक vivo वातावरण mimics कि एक सेटिंग है, और कुछ कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामक प्रकृति के संभवतः भविष्यवाणी में उनके रोलिंग गतिशीलता। एक संभव दृष्टिकोण व्यक्त GFP कैंसर कोशिकाओं के रोलिंग की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए प्रवाह चैम्बर परख के साथ साथ, इस तरह के GFP के रूप में 27 कैंसर की कोशिकाओं, के लिए एक लेबलिंग तकनीक गठबंधन करने के लिए हो सकता है। यह इस प्रक्रिया आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और रोग मॉडल के साथ संयोजन में अन्य प्रयोगशालाओं में प्रयोग के लिए संशोधित किया गया है कि कैसे देखना दिलचस्प होगा पदार्थों की एक किस्म के साथ चैम्बर कोटिंग और एक ही माउस के लिए कई कक्षों को जोड़ने के लचीलेपन को देखते हुए। हम यहाँ वर्णन तकनीक बस केवल अन्वेषक की रचनात्मकता से सीमित है कि एक बहुत व्यापक आवेदन क्षमता पर छू लेती है।
The authors have nothing to disclose.
R01EY022084 / एस 1 (केएमसी), T32EY007145 (एचएस) और P30EY014104: इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। अतिरिक्त सहायता मैसाचुसेट्स लायंस नेत्र रिसर्च फंड (केएमसी) और (केएमसी के लिए) को रोकने अंधापन रिसर्च से एक विशेष विद्वान पुरस्कार प्रदान किया गया।
Material | Vendor | Part number |
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
T tube | value plastics | T410-6 |
Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
35mm petri dish | Corning | 430165 |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
Fine forceps | FST | 11253-25 |
Fine scissors | FST | 15000-08 |
Tube holder | FST | 00608-11 |
Clamp applicator | FST | 18057-14 |
Vascular clamp | FST | 18055-04 |
6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
25x1G needles | BD | 305125 |
30×1/2G needles | BD | 305106 |
Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |