Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em> En Vivo</em> Imagen Óptico
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
Los liposomas se han investigado intensamente y servir como uno de los sistemas de administración de fármacos biomédicos más biocompatibles para aplicaciones clínicas 1,2. Ellos se componen principalmente de fosfolípidos y colesterol, ambos de los cuales son compuestos biocompatibles que imitan partes de las membranas celulares naturales. Considerando que las sustancias hidrófilas pueden ser atrapados en el interior acuoso, agentes lipófilos pueden incorporarse dentro de la bicapa fosfolipídica liposomal 3. La encapsulación de sustancias dentro del interior acuoso de los liposomas otorga protección contra la degradación in vivo y también evita que el sistema anfitrión de los efectos tóxicos de los fármacos citotóxicos utilizados para la terapia de enfermedades, por ejemplo agentes quimioterapéuticos destinados a destruir las células tumorales. La modificación de la superficie liposomal con polímeros como el polietilenglicol (PEGilación) se extiende aún más el tiempo de circulación de la sangre liposomal in vivo debido a la estabilización estérica 4. Moreover, los liposomas pueden secuestrar altas concentraciones de varias sustancias como proteínas 5,6, sustancias hidrófilas 7,8 y enzimas 9. Por lo tanto, sirven como herramientas terapéuticas y de diagnóstico clínico como fiables que merecen su aprobación para la entrega de fármacos citotóxicos tales como doxorrubicina para la terapia del cáncer 4. Debido a su flexibilidad, los liposomas también se pueden cargar con fluorocromos para fines de diagnóstico y quirúrgicos guiados por imagen.
Imágenes de fluorescencia proporciona una solución rentable y no invasiva herramienta de diagnóstico in vivo que, sin embargo, exige algunos requisitos básicos en. Se pudo demostrar que fluorocromos que se adaptan mejor para formación de imágenes in vivo tienen una absorción característica y máximos de emisión en el rango donde dispersión de la luz y la dispersión, así como la autofluorescencia de tejidos de origen del agua y de la hemoglobina es baja. Por lo tanto, dichas sondas tienen sus máximos de abs / em entre 650 y 900 nm 10. Además de esto, la estabilidad de los fluorocromos tanto in vitro como in vivo es crítica, como la opsonización y eliminación rápida pueden limitar en gran medida su aplicación para las imágenes in vivo 11. Otros efectos como la mala estabilidad y baja sensibilidad o efectos citotóxicos en órganos diana como se ha visto con el verde de indocianina (ICG) 12-16, son no deseados y deben tenerse en cuenta al diseñar sondas para imágenes in vivo. Estas observaciones han conducido al desarrollo activo de varios fluorocromos NIR preclínicos, nanopartículas, así como nuevas técnicas para la formación de imágenes in vivo de procesos inflamatorios, cáncer y para la cirugía guiada por imagen 17-20. A pesar de la estabilidad de la mayoría (fluorescencia del infrarrojo cercano) NIRF preclínica colorantes in vitro, su rápida perfusión y el aclaramiento a través del hígado y el riñón impiden su uso en la formación de imágenes ópticas in vivo de enfermedades y procesos inflamatorios.
ntent "> Por lo tanto, presenta un protocolo para la encapsulación de fluorocromos como el bien caracterizado en el infrarrojo cercano tinte fluorescente DY-676-COOH, conocido por su tendencia a la auto-interferencia a concentraciones relativamente altas 21 en liposomas. En altas concentraciones H- la formación de dímero y / o pi-interacciones de apilamiento entre las moléculas fluoróforo situadas dentro de resultado de cada uno radio de Förster en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre las moléculas de fluorocromo. A baja concentración el espacio entre las moléculas de fluoróforo se incrementa, impidiendo de este modo la interacción pi-apilado y -H formación de dímero y resultando en una alta emisión de fluorescencia. El interruptor entre alta y baja concentración y la extinción de la fluorescencia que acompaña y la activación es una estrategia prometedora que puede ser explotado para la formación de imágenes ópticas 22. A este respecto, la encapsulación de altas concentraciones del colorante NIRF DY-676-COOH en el interior acuoso de los liposomas es más favorable para formación de imágenes in vivo que el colorante libre. El desafío del método radica en primer lugar en la encapsulación correcta y en segundo lugar, en la validación de los beneficios resultantes de la encapsulación de altas concentraciones de colorante. La comparación de las propiedades de formación de imágenes de liposomas se inactivó con la del colorante libre y también con una formulación no liposómica se inactivó con bajas concentraciones del colorante es indispensable. Mostramos por un protocolo de hidratación de película y extrusión simple, pero muy eficaz combinado con congelación y descongelación ciclos alternos que la encapsulación de las concentraciones de extinción de DY-676-COOH en liposomas es factible. Otros métodos utilizados para preparar liposomas, tales como el método de evaporación de fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con altas eficiencias de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, la naturaleza de la sustancia a encapsular puede influir en la eficiencia de encapsulación. En efecto,el protocolo de hidratación de película y extrusión que aquí se presenta reveló la más alta eficiencia de encapsulación de DY-676-COOH. Para ilustrar los beneficios de la encapsulación liposomal de DY-676-COOH, un modelo de edema inducido por zymosan, que permite el estudio de los procesos inflamatorios dentro de unas pocas horas, fue utilizado. Aquí, se demuestra que los liposomas con altas concentraciones del encapsulado DY-676-COOH son más adecuados para todo el cuerpo pt imágenes ópticas vivo de los procesos inflamatorios que el colorante libre o la formulación liposomal no se inactivó con bajas concentraciones de colorante. Así, el protocolo subyacente proporciona un método sencillo y rápido para producir liposomas fluorescentes Templado y la validación de su potencial de activación y de formación de imágenes tanto in vitro como in vivo.Protocol
Representative Results
Discussion
Desde liposomas también pueden servir como sistemas de liberación para los tintes fluorescentes, que permiten imágenes de las enfermedades diana. La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF, DY676-COOH se utiliza aquí, conduce a un alto nivel de extinción de fluorescencia del colorante atrapado. Extinción de fluorescencia, un fenómeno visto con muchos fluoróforos en alta concentración puede ser explotado en varias aplicaciones de imagen en vivo, d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 y RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen mayo de asistencia técnica excelente y la compañía Dyomics GmbH, Jena por su amable apoyo.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
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