के लिए एक उपकरण के रूप में एक लिपोसोमल-समझाया पास अवरक्त की fluorophore प्रतिदीप्ति शमन<em> Vivo</em> ऑप्टिकल इमेजिंग
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
Liposomes अधिकता की जांच की और नैदानिक अनुप्रयोगों 1,2 के लिए सबसे biocompatible है जैव चिकित्सा दवा वितरण प्रणाली में से एक के रूप में काम किया गया है। वे मुख्य रूप से प्राकृतिक कोशिका झिल्ली के कुछ हिस्सों की नकल उतार biocompatible यौगिक होते हैं, जो दोनों के फॉस्फोलिपिड और कोलेस्ट्रॉल, से बना रहे हैं। हाइड्रोफिलिक पदार्थ जलीय इंटीरियर में फँस जा सकता है जबकि, lipophilic एजेंटों लिपोसोमल फॉस्फोलिपिड bilayer 3 में शामिल किया जा सकता है। Liposomes की जलीय इंटीरियर के भीतर पदार्थों के encapsulation विवो में गिरावट के खिलाफ संरक्षण देता है और यह भी ट्यूमर कोशिकाओं को नष्ट करने के उद्देश्य से उदाहरण केमोथेरापी के लिए रोगों के उपचार के लिए इस्तेमाल किया साइटोटोक्सिक दवाओं, के जहरीले प्रभाव से मेजबान सिस्टम को रोकता है। polyethylenglycol तरह पॉलिमर के साथ लिपोसोमल सतह के संशोधन (PEGylation) आगे के कारण sterical स्थिरीकरण से 4 विवो में लिपोसोमल रक्त परिसंचरण समय फैली हुई है। Moreovएर, liposomes ऐसे प्रोटीन 5,6, हाइड्रोफिलिक पदार्थ 7,8 और एंजाइमों 9 के रूप में कई पदार्थों की उच्च सांद्रता पृथक कर सकते हैं। वे इसलिए इस तरह के कैंसर के उपचार के लिए 4 डॉक्सोरूबिसिन रूप साइटोटोक्सिक दवाओं के वितरण के लिए उनकी मंजूरी योग्यता के रूप में जो विश्वसनीय नैदानिक चिकित्सीय और नैदानिक उपकरणों की सेवा। कारण उनके लचीलेपन के लिए, liposomes भी नैदानिक और छवि निर्देशित शल्य चिकित्सा प्रयोजनों के लिए fluorochromes साथ लोड किया जा सकता है।
प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदान करता है एक लागत प्रभावी और हालांकि, कुछ बुनियादी आवश्यकताओं की मांग जो विवो नैदानिक उपकरण में गैर इनवेसिव। यह vivo इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा सूट जो fluorochromes प्रकाश फैलाव और बिखरने के साथ ही पानी से होने वाले ऊतक autofluorescence और हीमोग्लोबिन कम है, जहां सीमा में विशेषता अवशोषण और उत्सर्जन Maxima है कि प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रकार, इस तरह के जांच के 650 और एनएम 10 900 के बीच उनके ABS / उन्हें Maxima है। Opsonization और तेजी से निकासी बहुत vivo इमेजिंग में 11 के लिए अपने आवेदन सीमित कर सकते हैं के रूप में इस के अलावा, इन विट्रो में और vivo में दोनों fluorochromes की स्थिरता, महत्वपूर्ण है। ऐसे गरीब स्थिरता और कम संवेदनशीलता या indocyanine ग्रीन (भारतीय तट रक्षक) 12-16 के साथ देखा के रूप में लक्ष्य अंगों पर साइटोटोक्सिक प्रभाव के रूप में अन्य प्रभाव, अवांछित हैं और vivo इमेजिंग के लिए जांच जब डिजाइनिंग को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इन टिप्पणियों कई पूर्व नैदानिक NIR fluorochromes, नैनोकणों के रूप में भी सूजन प्रक्रियाओं, कैंसर के vivo इमेजिंग के लिए और छवि निर्देशित सर्जरी 17-20 के लिए नई तकनीकों के सक्रिय विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। सबसे preclinical NIRF (लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति) की स्थिरता के बावजूद रंगों में इन विट्रो, जिगर और गुर्दे के माध्यम से उनके तेजी से छिड़काव और निकासी की बीमारियों और सूजन प्रक्रियाओं के vivo ऑप्टिकल इमेजिंग में उनके उपयोग में बाधा।
ntent "> इसलिए हम जैसे fluorochromes की encapsulation के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत अच्छी तरह से विशेषता लगभग अवरक्त liposomes में अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता 21 पर आत्म-बुझाने के लिए अपनी प्रवृत्ति के लिए जाना जाता फ्लोरोसेंट रंजक डी वाई-676-COOH,। उच्च सांद्रता में एच डिमर गठन और / या गड़बड़ी-stacking, फ्लोरोफोरे अणुओं बढ़ जाती है के बीच कम एकाग्रता में। अंतरिक्ष fluorochrome के अणुओं के बीच Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) में एक-दूसरे के फोर्स्टर त्रिज्या परिणाम के भीतर स्थित फ्लोरोफोरे अणुओं के बीच बातचीत जिससे गड़बड़ी-स्टैकिंग बातचीत रोकने और एच-डिमर गठन और उच्च प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप। उच्च और निम्न एकाग्रता और साथ प्रतिदीप्ति शमन और सक्रियण के बीच स्विच ऑप्टिकल इमेजिंग 22 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक आशाजनक रणनीति है। NIRF डाई की उच्च सांद्रता का इस संबंध में, encapsulation के liposomes की जलीय इंटीरियर में वाई-676-COOH अधिक एफए हैमुक्त डाई से vivo इमेजिंग के लिए vorable। विधि की चुनौती डाई की उच्च सांद्रता encapsulating से परिणामी लाभ के सत्यापन में, दूसरी बात सही encapsulation में सब से पहले और निहित है। डाई की कम मात्रा के साथ एक गैर-बुझती liposome निर्माण के साथ भी मुक्त डाई के साथ कि बुझती liposomes की इमेजिंग गुणों की तुलना और अपरिहार्य है। हम liposomes में वाई-676-COOH का शमन सांद्रता के encapsulation संभव है कि वैकल्पिक फ्रीज और पिघलना चक्र के साथ संयुक्त एक सरल है, लेकिन अत्यधिक प्रभावी फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना प्रोटोकॉल करके दिखाना। इस तरह के उलट चरण वाष्पीकरण विधि 23 के साथ ही इथेनॉल इंजेक्शन पद्धति के रूप में 24 liposomes तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है अन्य तरीकों कई हाइड्रोफिलिक पदार्थों के लिए उच्च encapsulation के क्षमता के साथ liposome तैयारी कर सकें। हालांकि, पदार्थ की प्रकृति encapsulation के दक्षता को प्रभावित कर सकते समझाया जाए। वास्तव में,यहाँ प्रस्तुत फिल्म जलयोजन और बाहर निकालना प्रोटोकॉल डी वाई-676-COOH के encapsulation के लिए उच्चतम क्षमता का पता चला। कुछ ही घंटों के भीतर सूजन प्रक्रियाओं का अध्ययन परमिट जो डी वाई-676-COOH, एक zymosan प्रेरित शोफ मॉडल की लिपोसोमल encapsulation का लाभ दर्शाते, इस्तेमाल किया गया था। यहाँ, यह समझाया डी वाई-676-COOH की उच्च सांद्रता के साथ liposomes मुक्त डाई या कम डाई सांद्रता के साथ गैर-बुझती लिपोसोमल तैयार करने से सूजन प्रक्रियाओं की विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में पूरे शरीर के लिए अधिक उपयुक्त हैं कि प्रदर्शन किया है। इस प्रकार अंतर्निहित प्रोटोकॉल बुझती फ्लोरोसेंट liposomes और इन विट्रो में और vivo में दोनों अपने सक्रियण और इमेजिंग क्षमता का सत्यापन का उत्पादन करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करता है।Protocol
Representative Results
Discussion
Liposomes भी फ्लोरोसेंट रंगों के लिए वितरण प्रणाली के रूप में काम कर सकते हैं, वे लक्ष्य रोगों की इमेजिंग कर सकें। ऐसे NIRF डाई, यहां इस्तेमाल DY676-COOH, के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों की उच्च सांद्रता के encapsulation फँस डाई की ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft हाई-698 / 10-1 अनुदान और आरयू 1652 / 1-1 के द्वारा समर्थित किया गया था। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और उनकी तरह की सहायता के लिए कंपनी DYOMICS जीएमबीएच, जेना के लिए डोरीन मई धन्यवाद।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
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