Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all'interno di liposomi come strumento per<em> In Vivo</em> Optical Imaging

Summary

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Abstract

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Introduction

I liposomi sono stati intensamente studiato e servire come uno dei sistemi di rilascio di farmaci biomedici più biocompatibili per applicazioni cliniche ^1,2. Essi sono composti principalmente di fosfolipidi e colesterolo, che sono entrambi composti biocompatibili mimano parti di membrane cellulari naturali. Considerando sostanze idrofile possono essere intrappolati all'interno acquosa, agenti lipofili possono essere incorporati all'interno liposomiale doppio strato fosfolipidico ^3. Incapsulamento di sostanze entro l'interno acquosa di liposomi garantisce la protezione contro la degradazione in vivo e impedisce anche il sistema host da effetti tossici di farmaci citotossici utilizzati per la terapia di malattie, per esempio chemioterapici volti a distruggere le cellule tumorali. La modifica della superficie liposomiale con polimeri come polietilenglicole (PEGylation) si estende ulteriormente il tempo di circolazione sanguigna liposomiale in vivo a causa di stabilizzazione sterica ^4. Moreover, liposomi possono sequestrare elevate concentrazioni di varie sostanze quali proteine, sostanze idrofile ^{5,6 7,8} e ⁹ enzimi. Servono pertanto strumenti terapeutici e diagnostici clinici affidabili che meritano la loro approvazione per la consegna di farmaci citotossici, come doxorubicina per la terapia del cancro ^4. Grazie alla loro flessibilità, liposomi possono essere caricati con fluorocromi per uso chirurgico di diagnostica e di immagine-guidata.

Imaging di fluorescenza prevede un costo-efficace e non invasivo de strumento diagnostico vivo che però, richiede alcuni requisiti di base. Si potrebbe dimostrare che fluorocromi che si adattano meglio per l'imaging in vivo hanno assorbimento caratteristico e massimi delle emissioni nel range in cui dispersione della luce e dispersione, nonché autofluorescenza dei tessuti d'origine da acqua ed emoglobina è bassa. Pertanto, tali sonde hanno il loro massimi abs / em tra 650 e 900 nm ^10. Oltre a questo, la stabilità di fluorocromi sia in vitro che in vivo è critica, come opsonizzazione e rapida clearance possono limitare notevolmente la loro applicazione per imaging in vivo ^11. Altri effetti quali la scarsa stabilità e bassa sensibilità o effetti citotossici sugli organi bersaglio come si è visto con verde di indocianina (ICG) ^12-16, sono indesiderati e devono essere presi in considerazione quando si progetta le sonde per l'imaging in vivo. Queste osservazioni hanno portato allo sviluppo attivo di diversi fluorocromi NIR preclinici, nanoparticelle nonché nuove tecniche di imaging in vivo di processi infiammatori, cancro e per immagine guidata chirurgia ^17-20. Nonostante la stabilità di più (fluorescenza vicino infrarosso) NIRF preclinico coloranti in vitro, la perfusione rapida e passaggio attraverso il fegato ei reni impediscono il loro uso in imaging ottico in vivo di malattie e processi infiammatori.

S copi "> Abbiamo quindi presentiamo un protocollo per l'incapsulamento di fluorocromi come il ben caratterizzato vicino infrarosso colorante fluorescente DY-676-COOH, noto per la sua tendenza ad auto-estinzione alle concentrazioni relativamente elevate ^{di 21} in liposomi. Ad alte concentrazioni H- formazione di dimero e / o-pi stacking interazioni tra molecole fluoroforo situate all'interno di ciascun altro risultato raggio Förster in Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) tra le molecole fluorocromi. In bassa concentrazione lo spazio tra le molecole fluoroforo aumenta, impedendo in tal modo l'interazione-pi impilamento e H-dimero formazione e la conseguente elevata emissione di fluorescenza. La commutazione tra alta e bassa concentrazione e l'accompagnamento della fluorescenza e l'attivazione è una strategia promettente che può essere sfruttata per l'imaging ottico ^22. A questo proposito, incapsulamento di alte concentrazioni di colorante NIRF DY-676-COOH all'interno acquosa di liposomi è più favorable per l'imaging in vivo che il colorante libera. La sfida del metodo consiste innanzitutto nel incapsulamento corretta e in secondo luogo, la validazione dei benefici derivanti da incapsulare alte concentrazioni di colorante. Confrontando le proprietà di imaging di liposomi bonifica con quello del colorante libero ed anche con una formulazione non quenched liposomi con basse concentrazioni di colorante è indispensabile. Mostriamo da un protocollo pellicola idratazione ed estrusione semplice, ma molto efficace in combinazione con gelo e disgelo alternative che l'incapsulamento delle concentrazioni tempra di DY-676-COOH in liposomi è fattibile. Altri metodi utilizzati per preparare liposomi come il metodo di evaporazione a fase inversa ²³ nonché il metodo di iniezione di etanolo ²⁴ consentono la preparazione di liposomi con alte efficienze di incapsulamento per molte sostanze idrofile. Tuttavia, la natura della sostanza da incapsulare può influenzare l'efficienza di incapsulamento. In effetti,il protocollo pellicola idratazione ed estrusione presentato qui ha rivelato la più alta efficienza per l'incapsulamento di DY-676-COOH. Per illustrare i vantaggi di incapsulamento liposomiale di DY-676-COOH, un modello edema zymosan indotta, che consente lo studio dei processi infiammatori in poche ore, è stato utilizzato. Qui, è dimostrato che liposomi con alte concentrazioni della incapsulato DY-676-COOH sono più adatti per tutto il corpo de imaging ottico vivo di processi infiammatori rispetto colorante libero o la formulazione liposomiale non quenched con concentrazioni basse colorante. Così il protocollo sottostante fornisce un metodo semplice e veloce per produrre liposomi fluorescenti bonifica e la validazione della loro attivazione e di imaging potenziale sia in vitro che in vivo.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sono approvate dal Comitato regionale animali e in conformità con le linee guida internazionali sull'uso etico degli animali. 1. Preparazione dei Materiali e strumenti Preparazione della dispersione delle vescicole spontaneamente formate (SFV) Sciogliere e preparare le soluzioni madre delle seguenti fosfolipidi: 214 mg / ml fosfatidilcolina d'uovo (EPC), 134 mg / ml di colesterolo, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosph…

Representative Results

L'incapsulamento di alte concentrazioni di coloranti fluorescenti come la NIRF dye DY676-COOH qui utilizzato all'interno acquosa di liposomi porta ad un elevato livello di estinzione della fluorescenza. Fluorescenza tempra, un fenomeno visto con molti fluorofori ad alta concentrazione, può essere sfruttata in diversi in applicazioni di imaging in vivo in cui una elevata sensibilità e rilevamento affidabile dell'area di destinazione sono richiesti. L'uso di liposomi fornisce anche una …

Discussion

Dal liposomi possono anche servire come sistemi di consegna per tinture fluorescenti, che permettono l'imaging di malattie in questione. L'incapsulamento di alte concentrazioni di coloranti fluorescenti come il colorante NIRF, DY676-COOH usato qui, porta ad un elevato livello di estinzione della fluorescenza del colorante intrappolato. Fluorescenza tempra, un fenomeno visto con molti fluorofori ad alta concentrazione può essere sfruttata in diversi de applicazioni di imaging in vivo, dove è r…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Materials and equipments for preparation of liposomes
egg phospahtidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)
cholesterol	Sigma	C8667	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	880120P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)
1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	810145P	Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)	Sartorius AG	Research RC 210 P	used for weighing the phospholipids
Rotavapor	Büchi Labortechnik AG	R-114	used for hydration of phospholipid film
Waterbath	Büchi Labortechnik AG	R-481	used for hydration of phospholipid film
Vacuum Controller	Büchi Labortechnik AG	B-720	used for hydration of phospholipid film
Vacobox	Büchi Labortechnik AG	B-177	used for hydration of phospholipid film
Circulation Chiller	LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG	WKL 230	used for hydration of phospholipid film
DY-676-COOH	Dyomics GmbH	676-00	Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan	Applichem	A1086	buffer 10 mM, pH 7.4
Trichlormethan	Carl Roth GmbH + Co. KG	Y015.2	used for liposome preparation
Sonicator	Merck Eurolab GmbH	USR 170 H	used for liposome preparation
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)	Scientific Industries Inc.	SI-0256	used for liposome preparation
Sephadex G25 medium	GE Healthcare Europe GmbH	17-0033-01	used for liposome purification
Triton X100	Ferak Berlin GmbH	505002	used to destruct liposomes  for dye quantification
LiposoFast-Basic	Avestin Inc.		used for the extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)	VWR		used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic
Fluostar Optima	BMG Labtech		used for dye quantification
Zetasizer Nano ZS	Malvern		used for the determination of liposome size and zetapotential
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter GmbH	XL 80	used for concentration of the samples
Rotor	Beckmann Coulter GmbH	SW 55 TI	used for concentration of the samples
Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging
Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae	Sigma	Z4250-250MG	used for induction of inflammation
Isotonic Saline (0.9)	Fresenius GmbH	PZN-2159621	used for the dilution of Zymosan-A
Isoflurane vaporizer	Ohmeda Isotec 4		used for anesthesizing animals
Isoflurane	Actavis GmbH	PZN-7253744	anesthesia
Thermo Mat Pro 20 W	Lucky Reptile	61202-HTP-20	used to keep animals warm during anesthesia
Omnican-F (1 ml injection)	Braun	PZN-3115465	used for subcutaneous and intravenous application of probes
Panthenol eye cream	Jenapharm	PZN-3524531	used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia
Hanks buffered saline solution	PAA Laboratories /Biochrom AG	L2045	w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells
8-Well chamber slides	BD Biosciences	354108	used for cell culture followed by microscopy
Cell culture flasks	Greiner BioOne
Cell culture media	Gibco (life technologies GmbH)
Fetal calf serum	Invitrogen
Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml)	Sigma	P4832	used to coat cell culture chamber slides
Mountant Permafluor	ThermoScientific	S21022-3	Mounting solution for microscopy
Hoechst-33258	AppliChem		DNA stain for microscopy
Hera-Safe	Heraeus Instruments		sterile work bench used for cell culture
HERA cell	Heraeus Instruments		Incubator used for cell culture
LSM510-Meta	Zeiss		used for confocal microscopy
Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system	CRi, Woburn		used for whole body fluorescence imaging of small animals
Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)	GE Healthcare		used for measurement of absorption
Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)	Jasco		used for measurement of fluorescence emission
Animals
NMRI mice (8-12 weeks old, male)	Elevage Janvier, France		used for inflammation trials