Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em> In Vivo</em> Imageamento óptico
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
Os lipossomas têm sido intensivamente investigados e servir como um dos sistemas de fornecimento de drogas biomédicas mais biocompatíveis para aplicações clínicas 1,2. Eles são compostos principalmente de fosfolípidos e colesterol, ambos os quais são compostos que imitam biocompatíveis partes de membranas celulares naturais. Considerando que as substâncias hidrofílicas podem ser encapsulados no interior aquoso, agentes lipofilicos podem ser incorporados no interior da bicamada fosfolipídica lipossomal 3. A encapsulação de substâncias no interior aquoso dos lipossomas concede protecção contra a degradação in vivo e também evita que o sistema hospedeiro contra os efeitos tóxicos de fármacos citotóxicos utilizados para a terapia de doenças como, por exemplo, agentes quimioterapêuticos destinados a destruir as células tumorais. A modificação da superfície de lipossomas com polímeros como o polietilenoglicol (PEGuilação) estende-se ainda mais o tempo de circulação no sangue de lipossomas in vivo devido à estabilização estérico 4. Moreover, os lipossomas podem sequestrar concentrações elevadas de várias substâncias, tais como proteínas, substâncias hidrófilas 5,6 7,8 9 e enzimas. Eles, portanto, servir de instrumentos terapêuticos e diagnósticos clínicos como confiáveis que merecem a sua aprovação para a entrega de medicamentos citotóxicos, como a doxorrubicina para terapia de câncer 4. Devido à sua flexibilidade, os lipossomas podem também ser carregadas com fluorocromos para fins cirúrgicos de diagnóstico e guiada por imagem.
Imagens de fluorescência fornece uma relação custo-benefício e não-invasivo em ferramenta de diagnóstico vivo que, no entanto, exige alguns requisitos básicos. Pode ser demonstrado que fluorocromos que se adequar melhor para a imagem in vivo têm absorção característica e máximos de emissão na faixa onde a dispersão de luz e espalhando bem como autofluorescência de tecidos de origem a partir da água e hemoglobina é baixo. Assim, tais sondas têm a sua maxima abs / em entre 650 e 900 nm 10. Além disso, a estabilidade de fluorocromos tanto in vitro como in vivo é crítico, como a opsonização rápida depuração e pode limitar muito a sua aplicação para a imagem in vivo 11. Outros efeitos como a má estabilidade e baixa sensibilidade ou efeitos citotóxicos em órgãos-alvo, como visto com indocianina verde (ICG) 12-16, não são desejadas e devem ser levados em consideração na concepção de sondas para a imagem in vivo. Estas observações conduziram ao desenvolvimento activo de vários fluorocromos NIR pré-clínicos, nanopartículas assim como novas técnicas de imagiologia in vivo de processos inflamatórios, cancro e para cirurgia guiada por imagens 17-20. Apesar de a estabilidade de mais (de fluorescência no infravermelho próximo) NIRF pré corantes in vitro, a sua perfusão rápida depuração e através do fígado e do rim impedir a sua utilização na imagiologia óptica in vivo de doenças e processos inflamatórios.
ntent "> Por isso, apresentam um protocolo para a encapsulação de fluorocromos tais como o bem caracterizado no infravermelho próximo corante fluorescente DY-676-COOH, conhecida pela sua tendência para a auto-arrefecimento rápido em concentrações relativamente elevadas 21 em lipossomas. A altas concentrações de H- a formação de dímeros e / ou interações entre as moléculas de fluoróforo localizados dentro resultado do outro raio Förster em Förster transferência de energia de ressonância (FRET) entre as moléculas de fluorocromo. Em baixas concentrações no espaço entre as moléculas de fluoróforo aumenta, impedindo assim a interacção de empilhamento de pi-empilhamento pi formação e resultando na emissão de fluorescência elevada H-dímero. O interruptor de entre alta e baixa concentração e a extinção da fluorescência de acompanhamento e de activação é uma estratégia promissora, que pode ser explorada para a imagiologia óptica 22. A este respeito, a encapsulação de concentrações elevadas de corante NIRF DY-676-COOH no interior aquosa de lipossomas é mais fafavorá- para geração de imagens in vivo do que o corante livre. O desafio do método situa-se em primeiro lugar no encapsulamento correcta e em segundo lugar, na validação dos benefícios resultantes de elevadas concentrações de encapsulação do corante. Comparando as propriedades de imagem de lipossomas desactivada com o do corante livre e também com uma formulação de lipossomas não-temperada com baixas concentrações do corante é indispensável. Mostramos por um protocolo de hidratação do filme e extrusão simples, mas altamente eficaz combinado com congelamento e descongelamento ciclos alternados que o encapsulamento das concentrações de extinção de DY-676-COOH em lipossomas é viável. Outros métodos utilizados para preparar lipossomas, tais como o método de evaporação de fase inversa 23 bem como o método de injecção de etanol 24 permitir a preparação dos lipossomas com elevadas eficiências de encapsulação para muitas substâncias hidrófilas. No entanto, a natureza da substância a ser encapsulada pode influenciar a eficiência de encapsulação. Com efeito,o protocolo de hidratação do filme e extrusão aqui apresentados revelaram a maior eficiência para o encapsulamento de DY-676-COOH. Para ilustrar os benefícios de encapsulamento lipossomal de DY-676-COOH, um modelo de edema induzido pelo zimosano, que permite o estudo de processos inflamatórios no interior de algumas horas, foi usado. Aqui, demonstra-se que os lipossomas com concentrações elevadas do encapsulado DY-676-COOH são mais adequados para o corpo inteiro em imagiologia óptica vivo de processos inflamatórios do que a do corante livre ou a formulação lipossomal não-temperada com baixas concentrações de corantes. Assim, o protocolo subjacente proporciona um método simples e rápido para a produção de lipossomas fluorescentes temperados e a validação da sua activação e imagiologia potencial tanto in vitro como in vivo.Protocol
Representative Results
Discussion
Uma vez que os lipossomas também podem servir como sistemas de entrega de corantes fluorescentes, que permitem imagiologia de doenças alvo. A encapsulação de concentrações elevadas de corantes fluorescentes, tais como o corante NIRF, DY676-COOH usado aqui, leva a um elevado nível de extinção de fluorescência do corante aprisionado. Extinção da fluorescência, um fenómeno observado com diversos fluoróforos em concentração elevada pode ser explorada em diversas aplicações em imagiologia in v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas subvenções Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 e RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen maio para assistência técnica excelente ea empresa DYOMICS GmbH, Jena por seu apoio tipo.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. . Liposomes a practical approach. , (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Bioquímica. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging–influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
