Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em> В Vivo</em> Оптических изображений
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
Липосомы интенсивно исследовали и служить в качестве одного из наиболее биосовместимых биомедицинских систем доставки лекарственных средств для клинического применения 1,2. Они, в основном, состоит из фосфолипидов и холестерина, оба из которых являются биосовместимыми соединения, имитирующие части природных клеточных мембран. В то время как гидрофильные вещества могут быть заключены в водном внутреннем пространстве, липофильные агенты могут быть включены в липосомальной фосфолипидный бислой 3. Инкапсуляция веществ в водном внутреннем пространстве липосом предоставляет защиту от деградации в естественных, а также предотвращает хост-системы от токсических эффектов цитотоксических лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, например химиотерапевтических направленных на разрушение опухолевых клеток. Модификация липосомной поверхности полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) дополнительно увеличивает время циркуляции крови в липосомальной естественных вследствие стерических стабилизации 4. Moreovэр, липосомы могут улавливания высокие концентрации различных веществ, таких как белки 5,6, гидрофильных веществ и ферментов 7,8 9. Таким образом, они служат в качестве надежного клинического лечебно-диагностические инструменты, которые заслуживают свое согласие на поставку цитотоксических препаратов, таких как доксорубицин для лечения рака 4. Благодаря своей гибкости, липосомы также могут быть загружены с флуорохромами для диагностических и графических наведением хирургических целей.
Флуоресцентной томографии обеспечивает экономически эффективный и неинвазивный в естественных условиях диагностического инструмента, которые, однако, требует некоторых основных требований. Это может быть продемонстрировано, что флуорохромы, которые подходят лучше для визуализации в естественных условиях имеют характеристическое поглощение и максимумов излучения в диапазоне, где дисперсия света и рассеяния, а также ткани аутофлюоресценция, происходящих из воды и гемоглобина является низким. Таким образом, такие датчики имеют свою абс / EM максимумов между 650 и 900 нм 10. Кроме того, стабильность флуорохромов в пробирке и в естественных условиях имеет решающее значение, так как опсонизация и быстрое оформление может значительно ограничить их применение для естественных изображений в 11. Другие эффекты, такие как плохой стабильностью и низкой чувствительности или цитотоксических эффектов на органы-мишени, как видно с индоцианина зеленого (ICG) 12-16, являются нежелательными и должны быть приняты во внимание при разработке зондов для визуализации в естественных условиях. Эти наблюдения привели к активному развитию нескольких доклинических NIR флуорохромии наночастиц, а также новых методов для визуализации в естественных условиях воспалительных процессов, рака и для имиджа наведением хирургии 17-20. Несмотря на стабильность большинства доклинических NIRF (ближней инфракрасной флуоресценции) красителей в пробирке, их быстрое перфузии и оформление через печень и почки препятствовать их использование в в естественных условиях оптической визуализации заболеваний и воспалительных процессов.
ntent "> Поэтому мы приводим протокол для инкапсуляции флуорохромами, таких как хорошо охарактеризованы в ближней инфракрасной области флуоресцентным красителем DY-676-COOH, известный своей склонностью к себе закалки при относительно высоких концентрациях 21 в липосомы. При высоких концентрациях Н димеров и / или пи-укладки взаимодействия между молекулами флуорофора, расположенных в пределах Ферстер результате друг друга радиуса в Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) между флуорохромом молекул. При малой концентрации пространство между увеличением молекул флуорофорные, тем самым предотвращая пи-укладки взаимодействия и Н-димеров и приводит к высокой эмиссии флуоресценции. переключение между высокой и низкой концентрации и прилагаемых тушение флуоресценции и активации является многообещающей стратегией, которая может быть использована для оптического изображения 22. В этом отношении, инкапсуляция высоких концентраций красителя NIRF DY-676-COOH в водном внутреннем липосом является более FAvorable для визуализации в естественных условиях, чем свободного красителя. Задача метода заключается в первую очередь в правильном инкапсуляции и, во-вторых, в проверке преимущества, вытекающие из инкапсуляции высокие концентрации красителя. Сравнивая свойства изображений закаленных липосом с этим свободного красителя, а также с не останавливают липосомной композиции с низким содержанием красителя не обойтись. Покажем на простом, но очень эффективном фильм гидратации и экструзии протокола в сочетании с альтернативными замораживания и оттаивания, что инкапсуляция тушения концентрации DY-676-COOH в липосомы возможно. Другие способы, используемые для получения липосом, такие как метод с обращенной фазой испарения 23, а также методом впрыска этанола 24 включить липосомного препарата с высокой эффективностью инкапсуляции для многих гидрофильных веществ. Однако природа вещества, которое необходимо инкапсулировать может влиять на эффективность инкапсуляции. В действительности,Фильм гидратации и экструзии протокол, представленные здесь показал высокую эффективность для инкапсуляции DY-676-COOH. Чтобы проиллюстрировать преимущества липосомальной инкапсуляции DY-676-COOH, в зимозаном-индуцированного отека модели, которая позволяет изучать воспалительных процессов в течение нескольких часов, был использован. Здесь показано, что липосомы с высокой концентрацией инкапсулированного DY-676-COOH являются более подходящими для всего тела в естественных условиях оптической визуализации воспалительных процессов, чем свободного красителя или не-гасили липосомной композиции с концентрацией низких красителей. Таким образом, основной протокол обеспечивает простой и быстрый способ получения закаленных люминесцентные липосомы и проверку их активации и визуализации потенциала как в пробирке и в естественных условиях.Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку липосомы могут также служить в качестве систем доставки для флуоресцентных красителей, они дают возможность визуализации целевых заболеваний. Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как краски, NIRF DY676-COOH используемых здесь, приводит к высокому у?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Немецкое исследовательское общество HI-698 / 10-1 и RU-1652 / 1-1. Мы благодарим Дорин мая за отличную техническую помощь и компании DYOMICS GmbH, Йена их поддержку.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. . Liposomes a practical approach. , (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Bioquímica. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging–influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
