Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em> İn Vivo</em> Optik Görüntüleme
Summary
The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.
Abstract
Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.
Introduction
Lipozomlar, yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve klinik uygulamalarda 1,2 en, biyo-uyumlu biyomedikal ilaç verme sistemlerinden biri olarak hizmet edilmiştir. Bunlar ağırlıklı olarak doğal hücre zarlarının bölümleri taklit eden biyolojik olarak uyumlu bileşikler, her ikisi de fosfolipidler ile kolesterol, oluşmaktadır. Hidrofilik maddelerin sulu iç kısım içinde kalan edilebilir iken, lipofilik maddeler, lipozomal fosfolipid çift-katlı 3 içine dahil edilebilir. Lipozomların, sulu iç kısmında maddelerin kapsüllenmesi, in vivo bozulmaya karşı koruma sağlar ve aynı zamanda tümör hücreleri yok etmeyi amaçlayan, örneğin kemoterapi için hastalıkların tedavisi için kullanılan sitotoksik ilaçların toksik etkileri ana sistemi engeller. polietilenglikole gibi polimerler ile lipozomal yüzeyinin modifikasyonu (PEGylation) ayrıca nedeniyle sterik stabilizasyon 4 in vivo lipozomal kan dolaşımı süresini uzatır. Moreover, lipozomlar gibi proteinler 5,6, hidrofil maddeler 7,8 ve enzimler 9 gibi çeşitli maddelerin yüksek konsantrasyonları çekilmek olabilir. Bu nedenle kanser tedavisi 4 doksorubisin gibi sitotoksik ilaçların verilmesi için onların onayını hak güvenilir klinik tedavi ve tanı araçları hizmet vermektedir. Dolayı esneklik, lipozomlar da teşhis ve görüntü kılavuzluğunda cerrahi amaçlı fluorochromes ile yüklenebilir.
Floresan görüntüleme sağlayan bir maliyet-etkin ve ancak, bazı temel gereksinimleri talep in vivo teşhis aracı non-invaziv. Bu, in vivo görüntüleme için en uygun fluorokromun ışık dağılımı ve saçılma yanı sıra sudan kaynaklanan doku otofloresansı ve hemoglobin düşük aralıkta karakteristik absorpsiyon ve emisyon maksimum seviyesine sahip olduğu gösterilebilir. Böylece, bu tür sondalar 650 nm ve 10 900 arasında kendi abs / em maxima var. Opsonizasyon ve hızlı temizleme büyük ölçüde, in vivo görüntüleme 11 için bunların uygulanmasını kısıtlar; gibi bu yanı, in vitro ve in vivo olarak florokromlar stabilitesi çok önemlidir. Bu tür zayıf kararlılık ve düşük hassasiyet ya da indosiyanin yeşilinin (ICG) 12-16 görüldüğü gibi hedef organlarda üzerinde sitotoksik etkiler gibi diğer etkiler, istenmeyen ve in vivo görüntüleme için sondalar tasarlarken dikkate alınması gerekir. Bu gözlemler, birçok ön-klinik NIR florokromlar, nanopartiküller olarak enflamatuar süreçler, kanser, in vivo görüntüleme ve görüntü kılavuzlu ameliyat 17-20 için yeni teknikler aktif gelişmesine yol açmıştır. En klinik öncesi NIRF (yakın kızıl ötesi floresan) stabilitesi rağmen boyalar in vitro karaciğer ve böbrek yoluyla hızlı bir perfüzyon ve temizlik hastalıkları ve inflamatuar süreçlere in vivo optik görüntüleme kullanılmasını engellemektedir.
ntent "> Bu nedenle örneğin florokrom kapsüllenmesi için bir protokol mevcut iyi karakterize yakın kızılötesi lipozomlar içinde oldukça yüksek konsantrasyonlarda 21 kendi kendini söndürme eğiliminden bilinen fluoresan boya DY-676-COOH. Yüksek konsantrasyonlarda H dimer oluşumu ve / veya bir pi-istiflenmesi, flüorofor molekülleri artışı arasındaki düşük bir konsantrasyonda. alan florokrom moleküller arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) birbirlerinin Förster yarıçapı sonucu içinde bulunan florofor molekülleri arasındaki etkileşimi ve böylece bir pi-istifleme etkileşimi önleme ve 'H-dimer oluşumu ve yüksek floresan emisyonu. Yüksek ve düşük konsantrasyonu ve eşlik eden floresans ve aktivasyonu arasında geçiş optik görüntüleme 22 yararlanılabilir gelecek vaat eden bir stratejidir. NIRF boyanın yüksek konsantrasyonlarda Bu bağlamda, sarma Lipozomlar, sulu iç DY-676-COOH daha falıdırserbest boya daha in vivo görüntüleme için vorable. Yöntemin meydan boya yüksek konsantrasyonlarda kapsüllenmesi kaynaklanan faydaların doğrulama, ikincisi doğru kapsülleme tüm ilk ve yatıyor. Boya düşük konsantrasyonlarda olmayan bir söndürüldü lipozom formülasyonu ile ücretsiz boya o ile söndürüldü lipozomlann görüntüleme özelliklerinin karşılaştırılması ve vazgeçilmezdir. Biz lipozomlarda DY-676-COOH söndürme konsantrasyonlarının kapsülleme mümkündür alternatif donma ve çözülme döngüleri ile birlikte basit, ama son derece etkili bir film hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü tarafından gösteriyor. Bu tür ters fazlı buharlaştırma yöntemi 23 olarak etanol enjeksiyon metoduna 24 gibi lipozomlar elde etmek için kullanılan diğer yöntemler, bir çok hidrofilik madde için yüksek bir kapsülleme randımanı olan lipozom preparatı sağlamaktadır. Bununla birlikte, maddenin doğası kapsülleme etkinliğini etkileyebilir haline getirilir. Sonuç olarak,Burada sunulan film, hidrasyon ve ekstrüzyon protokolü DY-676-COOH enkapsülasyonunda en yüksek verimi ortaya çıkardı. Birkaç saat içinde iltihap işlemlerinin çalışmasına izin verir DY-676-COOH, bir zimosan kaynaklı ödem modelinde, lipozomal kapsülleme yararlarını göstermek için kullanılmıştır. Burada, bu kapsüllenmiş DY-676-COOH konsantrasyonu yüksek olan lipozomlar, serbest boya ya da düşük boya konsantrasyonları olmayan söndürüldü lipozom formülasyonuna göre ateşli süreçlerin ve in vivo optik görüntüleme bütün vücut için daha uygun olduğu gösterilmiştir. Böylece, alt protokol söndürüldü floresan lipozomlar ve in vitro ve in vivo olarak hem aktivasyonu ve görüntüleme potansiyelinin doğrulama üretmek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir.Protocol
Representative Results
Discussion
Lipozomlar aynı zamanda flüoresan boyalar için iletim sistemleri olarak kullanılabilir olduğundan, bunlar hedef hastalıklar görüntüleme sağlar. örneğin NIRF boya, burada kullanılan DY676-COOH, gibi floresan boyalar yüksek konsantrasyonlarda kapsülleme tutulmuş boyanın flüoresan söndürme yüksek düzeyde olur. Floresan söndürme, yüksek konsantrasyonda birçok floroforlar görülen bir olgu hedef alan bir yüksek hassasiyet ve güvenilir algılama talep edilen in vivo görüntüleme uygulam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 hibe ve RU-1652 / 1-1 ile desteklenmiştir. Biz mükemmel teknik yardım ve destekleri için şirket DYOMICS GmbH, Jena için Doreen Mayıs teşekkür ederiz.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0,01% – 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
Referências
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe’s archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. . Liposomes a practical approach. , (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Bioquímica. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging–influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
