Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em> Xenopus laevis</em> Cones de Crescimento
Summary
A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.
Abstract
Microtúbulos (MT), além de rastreamento de-finais proteínas (+ TIPs) localizar às crescentes mais-extremidades de MTs e regular MT dinâmica 1,2. Uma das dicas mais conhecidos e amplamente utilizados + para analisar a dinâmica de MT é a de Ligação End proteína, EB1, que vincula todos os crescentes MT plus-fins, e, portanto, é um marcador de MT polimerização 1. Muitos estudos de comportamento EB1 dentro cones de crescimento usaram demorado e assistidas por computador, métodos de mão-de rastreamento tendenciosas para analisar indivíduo MTs 1-3. Nossa abordagem é quantificar os parâmetros globais da dinâmica MT utilizando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software é um open-source, o pacote user-friendly baseada em MATLAB que combina detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Aqui, apresentamos o protocolo para o uso plusTipTracker para a análise dos cometas PONTA + fluorescente marcado na cultura cones de crescimento Xenopus laevis. No entanto, este software também pode ser utilizado para caracterizar a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8.
Introduction
O objetivo deste método é a obtenção de informações quantitativas sobre microtúbulos (MT) mais-final rastreamento dinâmica em cones de crescimento vivendo proteína (+ TIP). MT + dicas são um grupo de proteínas que localizam as mais-ends de MTs 9,10. Eles executam uma série de funções para regular os parâmetros de MT instabilidade dinâmica 11, incluindo taxa de polimerização, catástrofe, e de resgate. Um método bem utilizado para analisar dinâmica MT é para controlar o comportamento da EB1 PONTA +, que se liga especificamente a crescimento mais MT-termina 1,12. EB1 é conhecido por recrutar várias outras proteínas para o crescimento de MT plus-termina 13,14, e, recentemente, foi estabelecida como um fator de maturação MT 15, promovendo o crescimento MT e frequência catástrofe 15,16.
Muitos estudos de dinâmica de MT em cones de crescimento têm utilizado métodos de mão-de monitoramento para medir as mudanças na dinâmica EB1-GFP ao longo do tempo 1-3, como EB1 localizatipara além de MT-extremidades pode ser utilizado como um marcador para a polimerização de MT. Um dos principais benefícios para a análise cometas EB1-GFP como um proxy para o crescimento MT é que a dinâmica de MT pode ser medida, mesmo em regiões de sobreposição MT significativo. Enquanto o método de cometas EB1-GFP-tracking mão contribuiu positivamente em MT comportamentos 1-3, é demorado e pode ser tendenciosa. Além disso, como o crescimento anormal comportamentos cone são provavelmente o resultado de mudanças de hora em dinâmica do citoesqueleto, analisando apenas um pequeno subconjunto de MTs (geralmente necessário quando a mão-tracking) pode perder informações importantes.
Assim, podemos medir parâmetros de dinâmica MT globais usando o pacote de software, plusTipTracker 4, após a aquisição de alta resolução, imagens ao vivo de EB1 com etiquetas em cultura cones de crescimento embrionárias 5. Este software, desenvolvido no Laboratório de Danuser, tem sido usado em vários estudos que caracterizam a dinâmica MT em vários tipos de células 6-8. É um open-source, noser-friendly, pacote baseado em MATLAB, que inclui detecção automática, rastreamento, visualização e análise de filmes de + TIPs fluorescente marcado. Uma longa lista de parâmetros específicos da dinâmica de MT são calculados por este software (ver referência 4 para mais detalhes), mas para a análise da dinâmica de MT em cones de crescimento, os parâmetros mais úteis são MT velocidade pista crescimento (em microns / minuto), a trilha de crescimento vida (em segundos) e duração da faixa de crescimento (em microns). O software pode ser baixado diretamente do site da Danuser Lab (em "Software"). Enquanto o Lab Danuser atualmente suporta uma interface mais recente para + análise de rastreamento TIP, que está incorporado em um pacote de software chamado u-track 2.0, o software original, autônomo continuará disponível. Os algoritmos subjacentes entre os dois programas são os mesmos (pelo menos a partir de 2014), com apenas uma diferença de interface e análise de resultados. Para o usuário iniciante com pouca MATLAB e / ou computacional experi análisecia, plusTipTracker tem características mais user-friendly, incluindo saídas automatizadas de parâmetros estatísticos.
Aqui, descrevemos os passos para a análise de imagens da dinâmica EB1-GFP em cultura cones de crescimento Xenopus laevis. Este protocolo foi utilizado em um artigo recente que examina MT dinâmica 17. Veja também Lowery et al. 2.012 5 para instruções detalhadas sobre cones de crescimento cultura expressando EB1-GFP. Embora este artigo focado principalmente na análise dinâmica EB1-GFP em cones de crescimento, o mesmo protocolo pode ser utilizado para outros tipos de células 17. Para todos os tipos de células, o intervalo de tempo entre os quadros deverão ser entre 0,5-2 seg para o rastreamento + TIP óptima. Um intervalo de tempo de até 4 segundos entre os quadros é possível, mas este aumento do tempo de intervalo resulta em erros de rastreio adicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker fornece uma interface gráfica de usuário simples para detectar de forma rápida e automaticamente cometas EB1-GFP praticamente todos visíveis em um cone ou crescimento celular, ligar os cometas em faixas, e calcular os parâmetros MT. Outras publicações relataram o desenho de tipos similares de software (por exemplo, Marx et al. Análise quantitativa utilizou também da dinâmica EB1 marcados em cones de crescimento 18). Mas, este software parece ser único em sua facilidade de ac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
Referências
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
- Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
- Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
- Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).
- Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
- Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413 (2012).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
- Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule ‘plus-end-tracking proteins’: The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
- Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
- Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
- Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
- Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22 (2013).
- Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).
