Summary

العصبية زرع الخلايا الجذعية في التجريبية Contusive نموذج من إصابة الحبل الشوكي

Published: December 17, 2014
doi:

Summary

إصابة الحبل الشوكي هي حالة الصدمة التي تسبب الاعتلال الشديد وارتفاع معدل الوفيات. في هذا العمل ونحن تصف بالتفصيل نموذج كدمة من إصابة الحبل الشوكي في الفئران تليها زرع الخلايا الجذعية العصبية.

Abstract

إصابة الحبل الشوكي هو شرط السريرية مدمرة، وتتميز مجموعة معقدة من الاختلالات العصبية. نماذج حيوانية من إصابة الحبل الشوكي يمكن استخدام كلا للتحقيق في الاستجابات البيولوجية للإصابة واختبار العلاجات المحتملة. كدمة أو ضغط إصابة تسليمها إلى الحبل الشوكي يتعرض جراحيا هي النماذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض. في هذا التقرير يتم تنفيذ كدمة التجريبية باستخدام اللانهائي الأفق (IH) جهاز المتصادم، والذي يسمح بإنشاء نموذج حيواني إصابة استنساخه من خلال تعريف المعلمات إصابة محددة. يعتبر زرع الخلايا الجذعية عادة استراتيجية يمكن أن تكون مفيدة لعلاج هذا الشرط المنهكة. وتقييم دراسات عديدة آثار زراعة مجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية. نحن هنا لشرح طريقة تكييفها لإصابة الحبل الشوكي يليه الذيل الوريد حقن الخلايا في الفئران CD1. باختصار، نحن نقدم إجراءات ل: ط) وضع العلامات خلية وايعشر التتبع الحيوي، والثاني) الرعاية ما قبل المنطوق من الفئران، الثالث) تنفيذا لإصابة الحبل الشوكي contusive، والرابع) الوريد من بعد الوفاة السلائف العصبية. ويمكن استخدام هذا النموذج كدمة لتقييم فعالية وسلامة زرع الخلايا الجذعية في نهج الطب التجديدي.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو الإصابة الأكثر شيوعا التي تسببها الصدمة ذات الطاقة العالية مثل الحوادث والسيارات، وتقع والرياضة والعنف 1. في SCI شديد، القوة إصابة بتدمير أو أضرار الأنسجة العصبية، مما تسبب في خسارة مفاجئة من وظيفة الجهاز العصبي. صدمة اصابات النخاع الشوكي غالبا ما يحدث لدى البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 10 و 40 سنة من العمر. أنه يؤثر بشكل كبير الحالة العقلية والجسدية للمريض ويسبب تأثير اقتصادي هائل للمجتمع 2. نهج العلاج في المرحلة الحادة غالبا ما يقتصر على جرعة عالية من الستيرويدات القشرية، وتحقيق الاستقرار الجراحي وإزالة الضغط لربما تخفيف مزيد من الضرر 3-4، ولكن أدوار هذه الأساليب على الانتعاش الحركي بعد اصابات النخاع الشوكي لا تزال مثيرة للجدل. بالإضافة إلى فقدان الأنسجة الحادة، والإصابات وتفعيل آليات الثانوية من انحطاط سبب إزالة الميالين والموت من أنواع الخلايا متعددة 5-6. درجة استعادة وظيفة يمكن للعشرة تكون مرتبطة إلى حد المادة البيضاء يدخر في مكان الاصابه 7.

ويمكن استخدام النماذج الحيوانية من اصابات النخاع الشوكي على حد سواء للتحقيق في الاستجابات البيولوجية للأنسجة للإصابة واختبار العلاجات المحتملة. وعلاوة على ذلك، وهو نموذج حيواني مفيد لأمراض البشري لديه ليس فقط لإعادة إنتاج بعض جوانب هذا الشرط ولكن أيضا يجب أن توفر المزايا على الملاحظة السريرية المباشرة والتجربة. النماذج المستخدمة على نطاق واسع من إصابة الحبل الشوكي تنطوي كدمة أو ضغط إصابة تسليمها إلى الحبل الشوكي يتعرض جراحيا 8. تطوير اصابة في الوزن الإفلات كدمة تسيطر تمثل معلما هاما في تاريخ البحوث اصابات النخاع الشوكي. مركز أبحاث النخاع الشوكي جامعة ولاية أوهايو انتهجت التحدي التكنولوجي للجهاز والتي يمكن استخدامها للحث على ضغط معين من الحبل الشوكي مع المعلمات من تأثير يسيطر عليها جهاز كمبيوتر 9. وقد تم تصميم هذا أصلا للاستخدام وايالفئران عشر. في وقت لاحق تم تعديله لتطبيق نحو 10 الفئران. مزايا هذا النوع من النهج هي أن الميكانيكا الحيوية الإصابة يمكن دراستها أكثر في العمق ويمكن تعريف المعلمات الإصابة بطريقة أكثر اكتمالا من أجل الحصول على نموذج تجريبي استنساخه، وبالتالي السماح للتقييم أكثر دقة للآثار العلاجات اختبارها على عملية الانتعاش وظيفية.

وتقييم العديد من الدراسات الآثار زرع مجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية في النماذج SCI 11. لقد عزل مؤخرا الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة الفرعية البطيني (SVZ) بعد عدة ساعات من وفاة المتبرع الماوس 12-13. يوفر هذا الإجراء السكان من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا تشريح الجثة السلائف العصبية (PM-الشخصيات)، والتي يبدو أن من المفيد في نهج الطب التجديدي لعلاج اصابات النخاع الشوكي. في هذه الورقة سوف نظهر: ط) بروتوكول لوصفها خلية مع التتبع PKH26 الحيوي، والثاني) في سورغالإجراء كال لأداء على الصدمة اصابات النخاع الشوكي، والثالث) في الوريد (IV) إدارة الخلايا المسمى. وعلاوة على ذلك، في هذا العمل نظهر أن الخلايا المزروعة تهاجر إلى العمود الفقري مواقع الآفة الحبل وتفرق معظمهم في أنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2 خلايا إيجابية. وعلاوة على ذلك، ويرافق التفريق من قبل تعزيز انتعاش مستقر في وظيفة هند أطرافهم.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة المراجعة من جامعة ميلان والتقى المبادئ التوجيهية الإيطالية لحيوانات المختبر في الامتثال مع المجتمعات التوجيه الأوروبي بتاريخ نوفمبر 1986 (86/609 / EEC): ملاحظة. 1. إعداد الخلايا لزرع <p class="jove_content" style=…

Representative Results

العدد الكلي للخلايا المزروعة هو 1 × 10 6 خلايا وقسمت إلى ثلاث حقن متتالية في الوريد الذيل. نحن تدار 3.3 × 10 5 خلايا في 50 ميكرولتر من حل العازلة الفوسفات (PBS). تم إجراء الحقن الأولى في غضون 30 دقيقة بعد الإصابة، في وقت لاحق 6 ساعة الثانية والساعة ال 18 الماضية بعد الآ?…

Discussion

في هذه الورقة وصفنا طريقة للحصول على نموذج استنساخه من إصابات في النخاع الشوكي باستخدام المتصادم الأفق اللانهائي في قوة من 70 kdyne (شديد). باستخدام نموذج قوة أكبر (80 kdyne)، ونحن يمكن أن يسبب إصابة أكثر الشديدة التي للأسف يرتبط معدل وفيات الفئران أعلى. من أجل تجنب هذه المشك?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10mg/ml Euroclone ECM0011B 1mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33cc 29G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

Referências

  1. . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
check_url/pt/52141?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

View Video