Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal
Summary
Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.
Abstract
Lesión de la médula espinal es una condición clínica devastadora, caracterizada por un complejo de disfunciones neurológicas. Los modelos animales de lesión de la médula espinal pueden ser utilizados tanto para investigar las respuestas biológicas a la lesión y para probar terapias potenciales. Contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente son los modelos más utilizados de la patología. En este informe, la contusión experimental se lleva a cabo utilizando el dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite la creación de un modelo animal de lesión reproducible través de la definición de los parámetros de lesión específica. El trasplante de células madre es considerada comúnmente una estrategia potencialmente útil para la curación de esta enfermedad debilitante. Numerosos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre. Aquí se demuestra un método adaptado para la lesión de la médula espinal seguida de la inyección de cola vena de células en ratones CD1. En resumen, ofrecemos procedimientos para: i) wi etiquetado celularº un trazador de vital importancia, ii) la atención pre-operatoria de los ratones, iii) la ejecución de una lesión de la médula espinal contundente, y iv) la administración intravenosa de post mortem precursores neuronales. Este modelo contusión puede ser utilizado para evaluar la eficacia y seguridad de trasplante de células madre en un enfoque de la medicina regenerativa.
Introduction
Una lesión de la médula espinal (SCI) es la lesión más común causada por traumatismos de alta energía como vehículos de motor accidentes, caídas, el deporte y la violencia 1. En grave SCI, la fuerza de la lesión destruye o daña el tejido neural, causando la pérdida repentina de la función neurológica. Traumático SCI se produce con frecuencia en adultos jóvenes de entre 10 y 40 años de edad. Afecta en gran medida la condición mental y física del paciente y causa enorme impacto económico para la sociedad 2. El enfoque de tratamiento en la fase aguda es a menudo limitada a una dosis alta de corticosteroides, la estabilización quirúrgica y descompresión a la posibilidad de atenuar daño adicional 3-4, pero las funciones de estos métodos en la recuperación del aparato locomotor después de SCI son aún controversial. Además de la pérdida de tejido agudo, la lesión traumática y la activación de mecanismos secundarios de degeneración causa la desmielinización y muerte de múltiples tipos de células 5-6. El grado de recuperación de la función puede dediez en proporción con la magnitud de la materia blanca escatimado en el sitio de la lesión 7.
Los modelos animales de SCI se pueden utilizar tanto para investigar las respuestas biológicas de los tejidos a la lesión y para probar posibles terapias. Por otra parte, un modelo animal útil de una patología humana no sólo tiene que reproducir algunos aspectos de esa condición, pero también debe ofrecer ventajas con respecto a la observación clínica directa y experimento. Los modelos más utilizados de lesión de la médula espinal implican contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente 8. El desarrollo de una lesión por contusión peso soltar controlado representa un hito importante en la historia de la investigación de SCI. El centro de investigación de la médula espinal Universidad del Estado de Ohio ha perseguido el desafío tecnológico de un dispositivo que se puede utilizar para inducir una compresión particular de la médula espinal con los parámetros de impacto controlados por un ordenador 9. Este fue originalmente diseñado para el uso wiratas th; más tarde se modificó para aplicar a los ratones 10. Las ventajas de este tipo de enfoque son que la biomecánica del accidente se pueden estudiar más en profundidad y los parámetros de lesión se pueden definir de una manera más completa con el fin de obtener un modelo experimental reproducible, por lo tanto, permitiendo una evaluación más precisa de los efectos de Los tratamientos probados en el proceso de recuperación funcional.
Muchos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre en modelos SCI 11. Hemos aislado recientemente adultos neural de células madre a partir de la Sub-Zona ventricular (SVZ) varias horas después de la muerte del donante ratón 12-13. Este procedimiento proporciona una población de células madre neuronales, llamado post mortem precursores neurales (PM-NPC), que parecen ser ventajoso en un enfoque de la medicina regenerativa para curar SCI. En este artículo vamos a demostrar: i) el protocolo para el etiquetado de células con el PKH26 trazador vitales, ii) la cirugiCal procedimiento para llevar a cabo en SCI traumática, y iii) la administración intravenosa (iv) la administración de células marcadas. Por otra parte, en este trabajo se demuestra que las células trasplantadas migran a sitios de lesión de la médula espinal y se diferencian principalmente en la proteína asociada a los microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Además, la diferenciación está acompañado por la promoción de una recuperación estable de la función de la extremidad posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se describe un método para obtener un modelo reproducible de lesión medular traumática utilizando un infinito horizonte Impactor con una fuerza de 70 Kdyne (grave). El uso de un paradigma de fuerza mayor (80 Kdyne), podemos causar una lesión más grave que por desgracia está asociada con la mortalidad ratones superiores. A fin de evitar este problema, que comúnmente escogemos un paradigma de fuerza moderada (70 Kdyne) que está asociado a una lesión repetible con una recuperación gradual de la fu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
Referências
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