Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
La transfección de ADN ha sido de gran valor para las ciencias biológicas y con los últimos avances en preparaciones de cortes de cerebro organotípicos, el efecto de varios genes heterólogos por lo tanto podría ser investigado fácilmente manteniendo muchos aspectos de la biología in vivo. Ha habido un interés creciente para transfectar neuronas terminales diferenciadas para las que los métodos de transfección convencionales han estado plagado de dificultades, tales como los bajos rendimientos y pérdidas significativas en la viabilidad. Transfección biolística puede eludir muchas de estas dificultades sin embargo, sólo recientemente se ha modificado esta técnica de modo que es susceptible para su uso en tejidos de mamíferos.
Nuevas modificaciones a la cámara de acelerador han mejorado la precisión de disparo de la pistola de genes y el aumento de sus profundidades de penetración mientras que también permite el uso de presión de gas inferior (50 psi) sin pérdida de eficiencia de la transfección así como permitir un margen regioselectiva enfocada del paARTÍCULOS para dentro de 3 mm. Además, esta técnica es sencillo y rápido de realizar que microinyecciones tediosas. Tanto expresión transitoria y estable son posibles con nanopartículas bombardeo donde la expresión episomal puede ser detectado dentro de 24 horas y la supervivencia de las células ha demostrado ser mejor que, o al menos igual a, métodos convencionales. Esta técnica tiene sin embargo una ventaja crucial: permite la transfección a ser localizados dentro de un solo radio restringido permitiendo así al usuario aislar anatómicamente efectos del gen heterólogo. Aquí presentamos un protocolo detallado para preparar adultos viable rebanadas organotípicos y someterlos a regioselectiva transfección utilizando una pistola de genes mejorada.
Originalmente la técnica biolistic, una frase a su vez-de-para "balística biológicos", se estableció para la transferencia génica mediada por partículas en las células vegetales 1. Este método físico de la transformación celular micro o nanopartículas acelera a alta velocidad para superar las barreras físicas de las membranas impermeables a las células con el fin de entregar cargamentos tales como ADN o colorantes. Debido a que no depende de ligando de receptores específicos y / o las propiedades bioquímicas en las membranas de la superficie celular, transferencia de genes mediada por partículas se puede aplicar fácilmente a una variedad de sistemas biológicos, tales como cortes de cerebro organotípicos.
Usando rebanadas organotípicos tienen ventajas sobre otros pt las plataformas in vitro ya que mantienen muchas de las propiedades anatómicas y bioquímicas que son pertinentes a la biología in vivo 2-4. Las rebanadas mayoría conservan las características arquitectónicas locales desde donde se han originado y preserve la actividad neuroquímica y la conectividad de las sinapsis. El uso de cortes de cerebro para la investigación básica, y en los esfuerzos farmacéuticos, ha aumentado de forma concomitante con el número de posibles manipulaciones biotecnológicas para medir y monitorear los comportamientos neurobiológicas del cerebro en un in vivo como contexto 3,5-7. Las principales ventajas para el uso de sistemas de ensayo a base de cortes organotípicos es que proporciona control experimental fácil y permite manipulaciones precisas de ambientes extracelulares.
Fructíferamente, sistemas de cultivo de cortes organotípicos se han establecido a partir de una variedad de regiones cerebrales, tales como, pero no limitado a, la corteza, la médula espinal y cerebelo 8-10. Además, un número de cocultivos se ha demostrado, que permiten la evaluación de la comunicación intercelular entre las regiones cerebrales distales así como entre las neuronas y las células patológicas 11,12. Muchos protocolos ya han sido establecidos para successfully rebanadas cultura organotípicos y puede mantener la viabilidad a largo plazo y muchos estudios recientes ahora utilizan los métodos de interfaz de membrana y varias modificaciones a la misma 13. Este principio mantiene las rebanadas organotípicos en la interfaz entre el medio y la atmósfera humidificada de la incubadora colocando las rodajas en un filtro de membrana porosa. El medio puede así proporcionar suficientes nutrientes para alimentar a las rebanadas organotípicos mediante movimiento capilar. Típicamente rebanadas se han preparado a partir de animales postnatales tempranos (3 – 9 días de edad; P3 – 9). Sin embargo, los tejidos del cerebro de estas rebanadas mostrar un alto nivel de plasticidad celular y tienen una resistencia inherente a los esfuerzos mecánicos, que es útil para obtener cultivos viables, sin embargo, las sinapsis maduras y circuitos neuroanatómico no se han desarrollado completamente in vivo hasta 2 a 3 semanas de edad 14. Por ejemplo, las observaciones anteriores habían demostrado que los cortes de hipocampo obtenidas de P0 – 1 neonatos, aunque muy viable siguiente preparación, perdiendo algunas características morfológicas. Esencialmente, ellos demostraron ser inadecuados para cultivos a largo plazo sugieren células inmaduras fueron más propensos a des-diferenciar en comparación con cultivos organotípicos de animales mayores 15,16. Por esta razón, nuestro método ha sido optimizado para los cortes de cerebro organotípicos adultos en la que la maduración y el desarrollo arquitectónico han llegado a sus etapas terminales 13,17-21. Sin embargo, este método también es adecuado para el recién nacido y rebanadas organotípicos juveniles.
Una vez que se han producido las rebanadas organotípicos viables toda la placa que contiene las rebanadas puede ser llevado al monte biolistic y sometido a regioselectiva entrega y transfección. El montaje correcto de la pistola de genes (como se describe en la Figura 1), orientado 90 ° a una distancia de 10 mm directamente sobre las rebanadas (desde la abertura en el tejido), permite el rápido suministro biolístico de los 40 nm irld partículas recubierto cargas. Estas cargas tales como tintes y vectores de ADN fluorescentes, así como cualquier gen de interés, se entregan fácilmente en las rodajas viables con facilidad. Así pues, este método describe el protocolo necesario para ofrecer, de una manera regioselectiva, carga recubierto las nanopartículas de oro en cortes de cerebro organotípicos viables. El cañón de la pistola de genes y montaje óptimo se puede ver en la Figura 1. Para más información sobre las mejores balística barril y nanopartículas, por favor ver O'Brien, et al., 17.
Refinamientos posteriores también están indicados para el usuario para optimizar las condiciones tales como la cantidad apropiada de oro entregado por área objetivo, definida como microportadores Cantidad de carga (MLQ), y para determinar la cantidad de ADN cargado por mg de oro, definido como de relación de ADN Cargando (DLR). Antes de la precipitación de ADN en partículas de oro y cargarlos en el tubo Tefzel que comprende cartuchos de la pistola de genes real '9 ;, es necesario para calcular la cantidad de ADN y el oro requerida para cada transfección que puede diferir ligeramente entre los tejidos y las condiciones (relación debe mantenerse entre 1 mg de oro y 1 g de ADN a 1: 5). Es vital para preparar la proporción adecuada de MLQ a DLR en contrario partículas de oro recubiertas de ADN podrían adherirse entre sí formando más grande que la aglomeración se esperaba, lo que podría reducir la homogeneidad global de la propagación biolistic así como daños incremento del tejido y la citotoxicidad.
Este método muestra las recientes mejoras en el suministro biolístico, que han sido probados y decididos a ser susceptibles de cortes de cerebro organotípicos neonatales, juveniles y adultos. Además, mediante la explotación de propagación reducida biolístico el gen arma de barril, el usuario es ahora capaz de transfectar de forma selectiva una región puntual en el cerebro. Tras el tiempo de incubación apropiado, la expresión de las proteínas fluorescentes, que alcanza sus tasas máximas entre 24 y 48hr, se puede visualizar mediante epifluorescencia y microscopía confocal. Estos fluoróforos permiten el análisis morfológico y la localización de las células individuales dentro de las estructuras biológicamente relevantes. Sin embargo, la modulación regioselectiva de las rebanadas organotípicos por otros genes heterólogos también puede ser controlado por cualquier otra prueba susceptibles de estas preparaciones. Posibles estrategias de trabajo para la entrega de genes localizados se presentan en la Figura 2.
The protocol describes approaches to deliver dyes and genetic materials into adult organotypic slices by using an enhanced gene gun. Essentially, the types of dyes and the variety of possible genes make this method multifaceted and amenable to answer a wide range of biological questions. The regioselective delivery method used, in this case to specific brain region, opens new avenues for experimentation as heterologous gene modulation of localized areas within a biologically relevant architecture hasn't been easily feasible before. We have previously determined that this method can be used on adult organotypic slices, where mature synapses are fully formed, as it showed improved cell survival and heterologous gene expression for many weeks13. With the advent of new and improved culture conditions for mammalian brains as well as other tissues, the use of regioselective genetic modulations will become increasingly useful for a wide variety of biochemical analyses.
As we shall highlight here and previously mentioned by others24, many different factors could readily affect the accuracy and reliability of biolistic delivery. Firstly, the preparation of the gold particle linked to dyes or DNA must be adequately balanced to prevent aggregation and to facilitate the cartridge cargo expulsion. Calcium and spermidine in the DNA-gold micro particles solution can aid the binding of DNA molecules to the gold nanoparticles. The ability for the nanoparticles to penetrate the cells under reduced pressure was previously determined17. Secondly, the gene gun must be mounted as steady as possible with the correct angle and distance. A reliable pressure gauge is also necessary for reproducibility, to maintain tissue integrity, and to properly accelerate the gold particles to their intended targets. Indeed, the distance, orientation, and stability of the equipment are also a crucial factors for the targeting and precision of regioselective delivery. As these brain structures are very small, minor variations in the firing angle could easily render the entire procedure less reliable. And finally, the preparation and maintenance of viable organotypic slices have been fraught with difficulties for many decades yet abundant and reliable protocols for different animals, brain regions, ages and cocultures are currently available2,4,25,26. These procedures should be user-optimized before submitting the tissues to biolistic procedures. This will more readily permit the user to unbiasedly ascertain the impact of the biolistic particles and the effect of the heterologous gene on their own cultures. To this end, the use of fluorescent genes such as EYFP and EGFP can both permit a novel user to test the targeting precision and also follow the cellular viability through heterologous gene expression over a sustained period of time13. Many of the critical steps for reliable and reproducible use of this protocol are highlighted in the following three paragraphs.
For efficient transfection, the DNA concentration must be appropriate. Concentrations that are too low would hinder the transfection yield while concentrations that are too high can cause agglomeration of the nanoparticles. Aggregates of gold can dramatically reduce transfection efficiency, cause uneven distributions, and can lead to increased cytotoxicity and oxidative stress. Problems with coating efficiency are likely due to the expiration of the spermidine solution (should be replaced every 2 to 3 months). For an adequate biolistic spread, the labeling must be even. A non-homogeneous labeling of the gold nanoparticle/DNA suspension may be due to the PVP solution. It should also be replaced every 2 to 3 months. Coating of the gold nanoparticles can be seen on agarose gel electrophoresis as a higher MW band27.
Each biological system under investigation as well as each different instrument used might require small changes in gas pressure to reach optimized levels of transfection and biolistic spread. The critical parameter is the pressure of the helium pulse required to strip the micro- or nano-carriers from the plastic cartridge and propel them into the tissue. A high gas pressure will affect cell survival, because it will create shock waves across the target and disrupt or detach the tissue from the matrix17. Aiming the gene gun barrel and having the apparatus exactly perpendicular to the tissue is important for accurate biolistic delivery. The selected area should be placed in the direct center of the barrel at precisely 10 mm from the outer aperture. This results in a 3 mm diameter of gold particle delivery around the epicenter. The gene gun barrel should be cleaned with 70% ethanol after each use. To protect the tissue from large particle aggregates, the barrel also contains a nylon mesh that should be replaced regularly to maintain optimum performance. In order to replace the mesh unscrew the cap then insert a new nylon mesh between the cap and the O-ring.
Fluorescently labeled cells should be visible at least 1 – 2 days after transfection around the epicenter. Absence or misalignment of labeling can result from inadequate preparation and instability of the gene gun mounting. The observations of cells using confocal microscopy depends on a number of factors: the wavelength of the excitation/emission light, pinhole size, NA of the objective lens, refractive index of components in the light path, depth of the tissue, and the alignment of the instrument. These factors should be optimized for each system under investigation.
Recent advances in biolistics were exploited for the success of this method. The gene gun barrel used in this study was modified in order to reduce the pressure necessary as well as funnel the biolistic scatter pattern into a more constrained and specific area17,19. Other barrel modifications have tried to restrict the biolistic spread and reduce the outflow pressure28 yet this custom designed gene gun barrel designed by Dr. O'Brien is a single component fitted to the standard Helios Gene gun. Subsequently, sub-micrometer gold particles were used to reduce the invasiveness of micrometer particles that we had previously determined caused cellular damage and ultimately, loss of sustained heterologous gene expression. These changes to the biolistic procedure improved the overall feasibility and reproducibility of the method13. Other improvements on slice preparation such as in-depth troubleshooting of the slicing procedure, using a DMEM-Agarose matrix to preserve the brain, and numerous other useful advances in organotypic brain slice preparation previously reported13 enabled us to explore the use of adult slices that have developed mature synaptic networks.
In our study we mainly used dyes and fluorescent heterologous genes to visualize cell morphology as a readout on transfection efficiency and an ability to image the morphological characteristics of neurons in mouse brain tissues. The signal to noise ratio of the stochastic delivery within a defined radius enabled us to completely isolate a single cell's dentritic harbor within its native context. As numerous efforts are used to investigate these morphological characteristics, mapping 'connectomics' or to label single cells for various analyses, this method could easily be combined with existing protocols such as electrophysiology and neurite measurements29,30. Evidently, combinations of fluorescent heterologous genes could enable a much more robust delineation of single cells as the stochastic distribution of fluorescent proteins, and their combination would determine the color of the individual cells31,32. The use of cell specific promoters such as synapsin and glial fibrillary acid protein upstream of the heterologous gene exon can also restrict the expression to subpopulations33. Indeed, the unending variety of genetic material could also be delivered in a regioselective manner by gold nanoparticles using this same procedure. The total transfected regions could thus be analyzed with traditional methods, such as dissection and submitting that region to western immunoblotting to analyze the localized effect of the heterologous gene.
Improvements in organotypic slice procedures will also permit wider use of brain tissues for long-term experimentation as well as permit the use of other tissues and cocultures and would facilitate transfection procedures. Lipid and polymer transfection have been previously reported to affect membrane homeostasis, internalization, protein permeability34 and frequently show very low efficiency to transfect terminally differentiated neurons. Cell specific cargo targeting is also amenable only to cells that express the cell surface receptors needed for internalization, and although this method can be highly selective, it can lack targeted regioselectivity35. Viral vectors otherwise are often difficult and costly to produce, require stringent regulations and have on occasion demonstrated safety concerns. Biolistic delivery thus has an unparalleled ability to regioselectively transfect neurons and other cell types within viable tissues. As gold is non toxic, further advances in the use of biolistics could pave the way for biomedical uses such as transdermal pharmaceutical delivery, noninvasive in vivo gene delivery, as well as localized nonviral gene therapies.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the MRC-LMB workshop for the production of the enhanced gene gun barrel. We would also like to thank Dr. David R. Hampson at the University of Toronto for the use of equipment and resources.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |