التيموس كاملة في الجرذان الكبار مع غير الغازية التنبيب الرغامي
Summary
Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.
Abstract
التيموس في القوارض حديثي الولادة هي إجراءات المتبعة وموثوق بها للدراسات المناعية. ومع ذلك، في الفئران البالغات، ومضاعفات النزف واسترواح الصدر من اضطراب الجنبي يمكن أن يؤدي إلى معدل وفيات كبيرة. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة لاستئصال التوتة الفئران التي تستخدم مصغرة القص والتنبيب الرغامي. ويتم إنجاز التنبيب مع طريقة غير الغازية واستنساخه بسهولة، ويسمح للتهوية بالضغط الإيجابي لمنع استرواح الصدر والشعب الهوائية للرقابة التي تتيح الوقت الكافي للدقيق الغدة الصعترية تشريح للحد من انقطاع الجنبي. وهناك 1.5 سم شق القصية يقلل اتصال مع السفن المنصفية وغشاء الجنب، في حين لا يزال توفير التصور الكامل للالغدة الصعترية. بعد التعرض للالمنصف، يتم إزالة الغدة الصعترية التي كتبها تشريح حادة تحت التكبير. ثم يتم مختومة الفضاء الجنبي من قبل الإغلاق خياطة العضلات قبل القصبة الهوائية تليها تطبيق الغراء الجراحي. الثم يتم إغلاق الصدر بإغلاق خياطة من القص، تليها إغلاق خياطة الجلد. كانوا جميعا thymectomies كاملة كما يتضح من المناعى (IHC) تلطيخ من الأنسجة المنصفية، وغياب T-خلايا ساذجة التدفق الخلوي، وكان الإجراء معدل البقاء على قيد الحياة 96٪. هذا الأسلوب هو مناسبة عندما هو المطلوب التيموس الكامل مع الحد الأدنى من المضاعفات لمزيد من الدراسات المناعية في الفئران الكبار athymic.
Introduction
منذ أوائل 1960s، وقد تم الاعتراف الغدة الصعترية لدوره الحيوي في تنمية التحمل المناعي المركزي. وقد ثبت القوارض التيموس أن يكون الإجراء أساسي في تحديد دور الغدة الصعترية في تمايز الخلايا اللمفاوية والتسامح الذات، وتحمل مناعي في تحديد زرع المزروع وورم خبيث. إزالة الغدة الصعترية الفئران تسمح للدراسات التي تنطوي على استنزاف T-الخلية أو نقل بالتبني من سكان الخلية T محددة دون عودة ظهور خلايا T ساذجة الأم.
Thymectomies في القوارض حديثي الولادة ويمكن تحقيق ذلك باستخدام تقنية الشفط مع نتائج يمكن الاعتماد عليها 1. في الفئران البالغات، ويرتبط هذا الأسلوب مع معدل وفيات تقريبي 20٪ والنتائج في كثير من الأحيان في التيموس غير مكتمل 2. لتحقيق باستمرار التيموس الكامل في الفئران الكبار، مطلوب التعرض المفتوحة للالمنصف من خلال القص المتوسط. ومع ذلك، هذاويرتبط الإجراء مع المضاعفات التي تشمل إصابة القصبة الهوائية، والنزف واسترواح الصدر مما يؤدي إلى معدل الوفيات الإجمالي تتراوح 1،5-6٪ 2- 4.
وعلى مدى العقدين الماضيين تحسينات في تقنيات التيموس انخفضت مضاعفات المحيطة بالجراحة وتحسنت معدلات البقاء على قيد الحياة. التنبيب الرغامي السماح للتهوية بالضغط الإيجابي قد تراجعت معدلات استرواح الصدر 5. طرق التنبيب وصف في وقت سابق مجموعة من التعرض مفتوحة إلى القصبة الهوائية إلى أساليب أقل الغازية باستخدام التصور الحبال الصوتية المباشر. المضاعفات المرتبطة إجراء التنبيب وتشمل إصابة القصبة الهوائية، وتمزق الحبال الصوتية، التنبيب المريء غير مقصود، ونزيف الناتجة عن ثقب في القلب أو تهتك من الوريد الأجوف العلوي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مقربة من فصوص الغدة الصعترية السفلى لبطانة الجنبي يؤدي إلى استرواح الصدر.
نحن هنا وصف تقنيةالتيموس من خلال مينيملي 2 سم شق الجلد التالية طريقة بسيطة لالتنبيب الرغامي باستخدام angiocatheter اضعافها نهاية والقصبة الهوائية عبر الجلد الإضاءة. والتيموس ينطوي على 1.5 سم القص وإغلاق ثلاث طبقات مع تطبيق الغراء الجراحي لختم المنصف والحد من حدوث النزف ومضاعفات في الجهاز التنفسي. هذه الطريقة يؤدي بشكل موثوق في التيموس كاملة كما يتضح من اختفاء CD4 + CD8 + وخلايا T ساذجة التالية التيموس وعدم وجود أنسجة الغدة الصعترية على IHC تلطيخ. يتم الاحتفاظ مرات المنطوق وفيات شبه الإجرائية إلى أدنى حد ممكن.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول لالتيموس الكامل نهج مينيملي مع شق ثلاث طبقات الإغلاق مع تطبيق الغراء الجراحية مصممة لتقليل المضاعفات. وقد تجلى إزالة كاملة من الغدة الصعترية عن فقدان خلايا T ساذجة وIHC تلطيخ من الأنسجة اللمفاوية المنصفية لcytokeratin.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by AI101263 from the National Institutes of Health (T.V.B), and by a grant from The Hartwell Foundation (M.L.M). M.L.M. is a member of the Duke Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2" 14-gauge angiocatheter | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| Warming pad | |||
| Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors | Harvard Apparatus | ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor) | |
| Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top) | See Figure 2 | ||
| Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank | Harvard Apparatus | ST1 72-6420 | |
| Small animal ventilator with tubing | CWE | 12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats) | |
| High-intensity Fiber-Optic Illuminator | Dolan Jenner | EEG 2823M | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools | 91100-16 | |
| Fine straight scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Blunt-tipped Shea scissors | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Small Alm retractor (for sternum) | Fine Science Tools | 17008-07 | |
| Blunt Graefe forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 5-0 Maxon sutures | Ethicon | ||
| 4-0 Silk sutures (with cutting needle) | Ethicon | ||
| 6-0 Nylon suture | Ethicon | ||
| Cyanoacrylate glue (Endermil) | |||
| Lubrication gel | Akorn Animal Health | NDC 17478-162-35 |
Referências
- Hard, G. C. Thymectomy in the neonatal rat. Lab. Anim. 9 (2), 105-110 (1975).
- Kobayashi, E., et al. A technique for complete thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 1759 (94), 0 (1994).
- Delrivière, L., Gibbs, P., Kobayashi, E., Kamada, N., Gianello, P. New technique of complete thymectomy in adult rats without tracheal intubation. Microsurgery. 18 (1), 6-8 (1998).
- Walker, K. G., Jacques, B. C., Tweedle, J. R., Bradley, J. A. A simpler technique for open thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 175 (1), 141 (1994).
- Na, N., Zhao, D., Huang, Z., Hong, L. An improved method for rat intubation and thymectomy. Chin. Med. J. (Engl). 124 (17), 2723-2727 (2011).
- Kastl, S., et al. Simplification of rat intubation on inclined metal plate). Adv. Physiol. Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).
- Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. A simplified method for endotracheal intubation in the rat. J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19 (4), 267-274 (2006).
- Zhao, D., et al. A model of isolated, vascular whole thymus transplantation in nude rats. Transplant Proc. 44 (5), 1394-1398 (2012).
- AbuAttieh, M., et al. Affinity maturation of antibodies requires integrity of the adult thymus. Eur. J. Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. Survival surgery: removal of the spleen or thymus. Curr. Protoc. Immunol. 1 (Unit 1.10), (2001).
- Siemionow, M., Izycki, D., Ozer, K., Ozmen, S., Klimczak, A. Role of thymus in operational tolerance induction in limb allograft transplant model. Transplantation. 81 (11), 1568-1576 (2006).
- Satoh, E., et al. Immunosuppressive effect of long-term drainage of thoracic duct on immunological memory in adult thymectomized rats. Transplant. Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).
- Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion. Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).
