पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के संभावित zebrafish मॉडल: की पछाड़ना<em> Wnt5a</em> Zebrafish गुर्दे में अल्सर का कारण बनता है
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
जेबराफिश (देनियो rerio) भ्रूण व्यापक रूप से गुर्दा विकास और पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। वहाँ एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के कई फायदे हैं: आनुवंशिक बातचीत का अध्ययन करने की व्यवहार्यता, प्रोटीन पछाड़ना के लिए antisense morpholinos (एमओ) का उपयोग करने की क्षमता है, अवसर जल्दी भ्रूण की बड़ी संख्या को परख करने के लिए, और अंग phenotypes के देखने की आसानी लार्वा एक रह रहे हैं। pronephros रीढ़ में विकसित करने के लिए पहले गुर्दे की है और लार्वा zebrafish 2 में कार्यात्मक है। zebrafish pronephros की संरचना स्तनधारी metanephros करने के लिए अपेक्षाकृत आसान तुलना में है, तीसरे और अंतिम गुर्दे स्तनधारियों में विकसित करने के लिए। नेफ्रॉन यह मुश्किल एकल नेफ्रॉन संरचना का पालन करने के लिए कर रही है, 500,000-1,000,000 नेफ्रॉन 3,4 और लगभग 13,000 नेफ्रॉन 5 होने प्रत्येक माउस गुर्दे के बीच युक्त प्रत्येक मानव गुर्दे के साथ, गुर्दे का काम कर इकाई है मैंएन मानव या माउस गुर्दे। zebrafish केवल दो नेफ्रॉन है, और प्रत्येक zebrafish नेफ्रॉन ग्लोमेर्युल्स और चूहों और इंसानों के 6 और इसी तरह के विशेष गुर्दे सेल प्रकार की नलिकाओं में पाया सभी प्रमुख घटक शामिल हैं। यह एक बंद व्यवस्था 7 है, क्योंकि इस तरह के Xenopus के रूप में अन्य हड्डीवाला मॉडल की तुलना में, zebrafish नेफ्रॉन अधिक बारीकी से स्तनधारी नेफ्रॉन जैसा दिखता है।
हाल के वर्षों में, zebrafish जीनोम आनुवंशिक उपकरण, व्यापक उत्परिवर्ती संसाधनों, और zebrafish मॉडल में ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों के संग्रह का विस्तृत परिचय की इजाजत दी, अनुक्रम किया गया है। 12-72 घंटा के बाद निषेचन (HPF) और बीच zebrafish pronephros रूपों पारदर्शी भ्रूण में आसानी से देखे जा सकते हैं। Wilm के ट्यूमर प्रोटीन WT1 गुर्दे के विकास के लिए एक अनिवार्य पहलू है। Wt1b प्रमोटर टीजी के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों (wt1b: GFP) के GFP के Expre दिखानेssion विशेष रूप से 17 HPF 8 से शुरू, zebrafish भ्रूण में pronephric क्षेत्रों में स्थित है। Nephronophthisis (NPHP), एक autosomal पीछे हटने सिस्टिक गुर्दा रोग, NPHP जीन 9 के म्यूटेशन के कारण होता है। (Wt1b: GFP) के morpholino द्वारा पछाड़ना NPHP4 टीजी में पुटी गठन का कारण बना। मछली 10 इसलिए, इस ट्रांसजेनिक मछली गुर्दे विकास के दौरान गुर्दे की संरचना और पुटी गठन के अवलोकन के लिए एक उपयुक्त मॉडल है। महत्वपूर्ण बात है, गुर्दे की विकास की modulators के प्रभाव एक समय और श्रम कुशल तरीके से इस तनाव का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।
जीन मॉडुलन के बाद गुर्दा पुटी गठन कल्पना करने के लिए एक मॉडल के रूप में मछली: हमारे पेपर टीजी (GFP wt1b) के उपयोग का वर्णन करता है। हम zebrafish में wnt5a जीन नीचे दस्तक करने के लिए प्रारंभ और ब्याह-साइट विरोधी भावना राज्यमंत्री का इस्तेमाल किया। Wnt5a विभिन्न अंगों और सेलुलर प्रसव के बाद के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि Wnt परिवार का एक गैर विहित स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन हैसमारोह 11। Wnt5a गुर्दे ट्यूबलर बढ़ाव दौरान उन्मुख कोशिका विभाजन में एक भूमिका निभा पाया गया है जो तलीय सेल polarity (पीसीपी) मार्ग, सहित गैर विहित Wnt रास्ते, के माध्यम से काम करता है। Wnt5a आगे जिससे Vangl2 स्थिरता 12 को बढ़ावा देने, VANGL तलीय सेल polarity प्रोटीन 2 (Vangl2) के साथ एक जटिल बनाने के द्वारा Wnt5a संकेतन पारगमन जो टाइरोसीन काइनेज तरह रिसेप्टर (Ryk), के साथ एक जटिल बनाने के द्वारा Wnt / पीसीपी मार्ग को नियंत्रित करता है। पीसीपी मार्ग में दोष यादृच्छिक कोशिका विभाजन में परिणाम और गुर्दे पुटी गठन हो सकता है। Wnt5a पछाड़ना निम्नलिखित गुर्दे पुटी गठन का निरीक्षण करने के लिए zebrafish लाइन: हम टीजी (GFP wt1b) का इस्तेमाल किया। टीजी (wt1b: GFP) के zebrafish मॉडल रहते इमेजिंग और गुर्दे की संरचना के समय पर अवलोकन की अनुमति देता है। Wnt5a पछाड़ना के बाद, गुर्दे पुटी गठन 24 HPF में शुरुआत पाया गया था; 72 HPF पर, अल्सर ग्लोमेरुली और समीपस्थ नलिकाओं में पाया जा सकता है। इस विधि को भी एस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैगुर्दे पुटी गठन के कारण हो सकता है कि creen अन्य जीनों।
Protocol
Representative Results
Discussion
पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) मनुष्यों में अंतिम चरण गुर्दे की बीमारी के प्रमुख कारणों में से एक है और प्रगतिशील पुटी गठन, गुर्दे की वृद्धि, और असामान्य छोटी नली विकास 14 की विशेषता है। ऑटोसोमल प्रमुख PKD …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (एलएच को DK093625, और DK069909 और DK047757 JHL करने के लिए) एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया था और वर्जीनिया (मेरिट पुरस्कार JHL को I01BX000820)। हम आवश्यक सहायता प्रदान करने के लिए पेंसिल्वेनिया Zebrafish कोर विश्वविद्यालय में डॉ माइकल पैक और डॉ जी वह शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
