Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em> Wnt5a</em> Provoca cisti in Zebrafish Reni
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) gli embrioni sono stati ampiamente utilizzati come modello per lo studio dello sviluppo del rene e rene policistico. Ci sono molti vantaggi di utilizzare zebrafish come un modello animale: la fattibilità di studiare le interazioni genetiche, la capacità di utilizzare Morpholinos antisenso (MO) per le proteine atterramento, l'opportunità di saggiare rapidamente un gran numero di embrioni, e la facilità di visualizzazione fenotipi organo in larve 1 vivono. I pronephros è il primo rene a sviluppare nei vertebrati ed è funzionale in zebrafish larvale 2. La struttura dei pronephros zebrafish è relativamente semplice rispetto alle metanefro mammiferi, la terza e ultima rene sviluppare nei mammiferi. Il nefrone è l'unità di lavoro del rene, con ogni rene umano contenente tra 500,000-1,000,000 nefroni 3,4 e ciascun rene del mouse con circa 13.000 nefroni 5, il che rende difficile osservare la struttura singola nefrone in reni umani o il mouse. Il pesce zebra ha solo due nefroni, e ogni nefrone zebrafish contiene tutti i principali componenti presenti nel glomerulo e tubuli di topi e gli esseri umani 6 e tipi di cellule renali specializzati simili. Rispetto ad altri modelli di vertebrati, come Xenopus, nefrone zebrafish assomiglia più da vicino il nefrone mammiferi perché ha un sistema chiuso 7.
Negli ultimi anni, il genoma zebrafish è stato sequenziato, permettendo l'ampia introduzione di strumenti genetici, ampie risorse mutanti, e raccolte di linee giornalista transgeniche nei modelli di zebrafish. Pronefro zebrafish forme tra 12-72 ore dopo la fecondazione (HPF) e possono essere visualizzati facilmente negli embrioni trasparenti. Proteina tumore del Wilm WT1 è un fattore essenziale per lo sviluppo del rene. Linee di zebrafish transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrano GFP espresfissione specificamente trova nelle regioni pronephric in embrioni di zebrafish, a partire dal 17 hpf 8. Nefronoftisi (NPHP), una malattia renale cistica autosomica recessiva, è causata da mutazioni di geni NPHP 9. NPHP4 atterramento da morpholino causato la formazione di cisti nel Tg (wt1b: GFP). Pesce 10 Pertanto, questo pesce transgenico è un modello adatto per osservare le strutture renali e formazione di cisti durante lo sviluppo del rene. È importante sottolineare che l'influenza di modulatori di sviluppo rene può essere studiata utilizzando questo ceppo in un tempo e manodopera modo efficiente.
Il nostro documento descrive l'uso di Tg (wt1b: GFP) pesce come modello per visualizzare rene formazione di cisti dopo la modulazione del gene. Abbiamo usato inizio e splice-site anti-senso MOs per abbattere il gene Wnt5a in zebrafish. Wnt5a è una glicoproteina secreta non canonica della famiglia Wnt che svolge un ruolo importante nello sviluppo dei vari organi e postnatale cellularefunzione 11. Wnt5a opera attraverso percorsi Wnt non canonici, tra cui il percorso di polarità planare delle cellule (PCP), che è stato trovato a svolgere un ruolo nella divisione cellulare orientato durante renale allungamento tubolare. Wnt5a regola l'/ PCP pathway Wnt formando un complesso con il recettore come tirosina chinasi (Ryk), che trasduce ulteriormente segnalazione Wnt5a formando un complesso con la proteina VANGL polarità cellulare planare 2 (Vangl2), promuovendo in tal modo la stabilità Vangl2 12. Difetti nella via PCP possono provocare divisione cellulare casuale e causare la formazione di cisti renale. Abbiamo usato il Tg (wt1b: GFP) Linea zebrafish per osservare la formazione di cisti renali dopo Wnt5a atterramento. Il Tg (wt1b: GFP) modello di zebrafish permette l'imaging dal vivo e l'osservazione puntuale della struttura del rene. Dopo Wnt5a atterramento, formazione di cisti renali è stato trovato con inizio alle 24 HPF; a 72 HPF, cisti potrebbero essere trovati nei glomeruli e tubuli prossimali. Questo metodo può essere utilizzato anche per sCreen altri geni che possono causare la formazione di cisti renali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rene policistico (PKD) è una delle principali cause di malattia renale allo stadio terminale nell'uomo ed è caratterizzata da progressiva formazione di cisti, l'allargamento renale, e lo sviluppo tubulo anormale 14. Autosomica dominante PKD (ADPKD) è una malattia genetica in cui la mutazione di una PKD1, codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, codifica policistina-2 (PC2), i risultati di reni policistiche. Molti altri geni, in particolare quelli che codificano proteine che si trovano nel cilium…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (DK093625 di LH e DK069909 e DK047757 a JHL) e la VA (Merit Award I01BX000820 a JHL). Vorremmo ringraziare il Dr. Michael Pack and Dr. Jie Egli presso l'Università della Pennsylvania Zebrafish core per fornire supporto essenziale.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
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