多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン<em> WNT5A</em>ゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）胚は広く腎臓発生および多発性嚢胞腎疾患を研究するためのモデルとして使用されている。遺伝的相互作用を研究することの実現可能性、タンパク質のノックダウン、迅速胚の多数のアッセイの機会、および器官の表現型を表示するのを容易にするためのアンチセンスモルフォリノ（MO）を使用する能力：動物モデルとしてゼブラフィッシュを使用することには多くの利点がある幼虫1を生きて。前腎 は脊椎動物で開発した最初の腎臓で、幼虫のゼブラフィッシュ2で機能的である。ゼブラフィッシュ前腎の構造は哺乳類の後腎、哺乳動物で開発するための3番目と最後の腎臓に比べて比較的簡単である。ネフロンが困難単一ネフロンの構造を観察すること、500,000-1,000,000ネフロン3,4及び約13000ネフロン5をそれぞれ有するマウス腎臓の間にそれぞれ含むヒト腎臓を、腎臓の作業単位でのinは、ヒトまたはマウスの腎臓。ゼブラフィッシュは2ネフロンがあり、各ゼブラフィッシュネフロンは、マウスとヒト6と類似した特殊な腎細胞型の糸球体と尿細管で見つかったすべての主要なコンポーネントが含まれています。それはクローズドシステム7を有しているので、このようなアフリカツメガエルなどの他の脊椎動物のモデルと比較すると、ゼブラフィッシュネフロンはより密接に哺乳類のネフロンに似ている。
近年では、ゼブラフィッシュのゲノムは、遺伝的なツール、広範な変異リソース、およびゼブラフィッシュモデルにおけるトランスジェニックレポーターラインのコレクションの幅広い導入を可能にする、配列決定されている。 12-72時間後に受精（ゼブラ）との間のゼブラフィッシュの前腎形態は透明な胚で容易に可視化することができる。ウィルムス腫瘍タンパク質WT1は、腎臓の開発のために不可欠な要素である。 wt1bプロモーターのTg（wt1b：GFP）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインはGFPのexpreを示すssionは、具体的には17 HPF 8から始まる、ゼブラフィッシュ胚で前腎領域に位置する。 Nephronophthisis（NPHP）、常染色体劣性嚢胞腎疾患は、NPHP遺伝子9の突然変異によって引き起こされる。モルホリノによるノックダウンNPHP4はTgは（wt1b：GFP）で嚢胞形成を引き起こした。魚10したがって、このトランスジェニック魚は腎臓開発中に腎臓の構造と嚢胞形成を観察するのに適したモデルです。重要なのは、腎臓発生の調節因子の影響は、時間と労力効率的な方法でこの株を使用して研究することができる。
遺伝子変調後の腎嚢胞形成を可視化するモデルとして魚：私たちの論文は、Tgは（GFP wt1b）の使用が記載されている。我々はゼブラフィッシュにおけるWNT5A遺伝子をノックダウンするスタート-とスプライス部位アンチセンスMOを使用。 Wnt5aのは、様々な器官および細胞出生後の発達に重要な役割を果たしているWntファミリーの非標準的な分泌糖タンパク質である機能11。 Wnt5aのは、尿細管伸長時の指向細胞分裂において役割を果たしていることが見出されている平面内細胞極性（PCP）経路を含む非カノニカルWnt経路を介して機能する。 Wnt5aのはさらに、それによってVangl2安定性12を推進し 、VANGL平面細胞極性タンパク質2（Vangl2）と複合体を形成することにより、Wnt5aのシグナルを伝達するチロシンキナーゼ（RYK）のような受容体と複合体を形成することによってWntシグナル/ PCP経路を調節する。 PCP経路における欠陥は、ランダムな細胞分裂を生じ、腎嚢胞形成を引き起こす可能性があります。 WNT5Aノックダウン以下の腎嚢胞形成を観察するためにゼブラフィッシュの行：私たちは、Tgは（GFP wt1b）を使用した。 Tgは（wt1b：GFP）ゼブラフィッシュモデルは、ライブイメージングと腎臓の構造のタイムリーな観察 を可能にする。 WNT5Aノックダウンした後、腎嚢胞形成は24 HPFから始まる発見された。 72 HPFで、嚢胞は糸球体と近位尿細管で見つけることができた。この方法は、sに使用することができる腎嚢胞形成を引き起こす可能性のある他の遺伝子をcreen。
Protocol
Representative Results
Discussion
多発性嚢胞腎（PKD）は、ヒトにおける末期腎疾患の主要な原因の一つであり、進行性の嚢胞形成、腎肥大、および異常な尿細管発生14によって特徴付けられる。常染色体優性PKD（ADPKD）ポリシスチン1（PC1）、またはPKD2、符号化ポリシスチン2（PC2）、多嚢胞性腎臓で結果をコードする、PKD1どちらのどの突然変異の遺伝的疾患である。多くの他の遺伝子、一次繊毛に見出さ特にコードす…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（JHLにLH、およびDK069909とDK047757にDK093625）およびVA（JHLに優秀賞I01BX000820）によってサポートされていました。私たちは本質的な支援を提供するためのペンシルベニア州ゼブラフィッシュコアの大学の博士マイケル·パックと博士傑彼に感謝したいと思います。
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
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