다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운<em> wnt5a</em> Zebrafish의 신장의 낭종 원인
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 배아 신장 널리 개발 다낭성 신장 질환을 연구 모델로서 이용되어왔다. 가지 동물 모델로서 지브라 피쉬를 사용하는 많은 장점 : 유전 결합 연구의 타당성은, 단백질 녹다운 대한 안티센스 morpholinos (MO)를 사용하는 능력은, 기회 신속 배아 다수를 분석하는, 그리고 오르간 표현형을 쉽게 볼 애벌레 한 생활. pronephros는 척추 동물에서 개발 한 최초의 신장과 애벌레 제브라 피쉬 2에서 작동합니다. pronephros 지브라 피쉬의 구조는 포유류 metanephros 비교적 간단한 비교되고, 마지막 세 번째 신장 포유류 개발. 네프론 어려운 네프론 단일 구조를 관찰 할 수있어 네프론 500,000-1,000,000 3,4- 약 13,000 네프론 (5)를 각각 갖는 마우스 신장 사이 각각 함유 인간 신장과 신장의 작업 단위 In은 인간 또는 마우스 신장. 제브라 피쉬는 두 개의 네프론을 가지고 있으며, 각각의 제브라 피쉬 네프론은 사구체와 생쥐와 인간 (6)와 유사한 전문 신장 세포 유형의 세관에있는 모든 주요 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이 닫힌 시스템 (7)을 가지고 있기 때문에 이러한 제노 같은 다른 척추 동물 모델에 비해, 제브라 피쉬 네프론보다 자세히 포유류 네프론을 닮았다.
최근, 제브라 피쉬 게놈 유전자 툴, 광범위한 돌연변이 자원, 제브라 피쉬 모델에서 트랜스 제닉 리포터 라인 모음 넓은 도입을 허용 서열화되었다. 12-72 시간 포스트 수정 (HPF) 간의 제브라 피쉬의 pronephros 양식은 투명 배아에서 쉽게 시각화 할 수 있습니다. Wilm의 종양 단백질 WT1 신장 개발을위한 필수적인 요소이다. wt1b 프로모터의 Tg의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 선 (wt1b : GFP) GFP의 expre을 보여ssion는 특히 17 HPF (8)에서 시작, 제브라 피쉬 배아에서 pronephric 지역에 위치하고 있습니다. Nephronophthisis (NPHP), 상 염색체 열성 낭성 신장 질환, NPHP 유전자 (9)의 돌연변이에 의해 발생합니다. (wt1b : GFP) 모르 폴리 노에 의해 넉다운 NPHP4은의 Tg 낭종 형성 원인이되었다. 물고기를 10 따라서,이 형질 전환 어류 신장 개발하는 동안 신장의 구조와 낭종 형성을 관찰에 적합한 모델입니다. 중요한 것은, 개발 신장의 조절제의 영향은 시간 및 노동 효율적인 방법으로이 균주를 사용하여 조사 할 수있다.
유전자 변조 후 신장 낭종 형성을 시각화하는 모델로 물고기 : 우리의 종이는 Tg가 (GFP wt1b)의 사용에 대해 설명합니다. 우리는 제브라 피쉬의 wnt5a 유전자를 허물고 시작 – 및 스플 라이스 – 사이트 안티센스 수법의 살인을 사용했다. Wnt5a 각종 장기 및 세포 생후의 개발에 중요한 역할이 Wnt 계열의 비정규 분비 된 당 단백질기능 11. Wnt5a은 신 세뇨관 신장 동안 지향 세포 분열에 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다 평면 셀 극성 (PCP) 경로를 포함하여 비정규의 Wnt 경로를 통해 작동합니다. Wnt5a 더함으로써 Vangl2 안정성 12을 촉진 VANGL 평면 셀 극성 단백질 2 (Vangl2)와 복합체를 형성함으로써 Wnt5a 시그널링을 transduces 티로신 키나제와 같은 수용체 (RYK)과 복합체를 형성함으로써이 Wnt / PCP 경로를 조절한다. PCP 경로의 결함은 임의의 세포 분열을 초래할 신장 낭종 형성의 원인이 될 수 있습니다. wnt5a 최저 다음 신장 낭종 형성을 관찰하는 제브라 피쉬 라인 : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)을 사용했다. Tg는 (wt1b : GFP) 제브라 피쉬 모델은 라이브 이미징 및 신장 구조의 적시 관찰 할 수 있습니다. wnt5a 최저 후, 신장 낭종 형성은 24 HPF에서 시작 발견되었다; 72 HPF에서 낭종은 사구체 근위 세뇨관에서 볼 수 있습니다. 이 방법은 또한 (S)에 사용될 수있다신장 낭종 형성 발생할 수 있습니다 creen 다른 유전자.
Protocol
Representative Results
Discussion
다낭성 신장 질환 (PKD)는 인간에서 말기 신장 질환의 주된 원인 중 하나이며, 프로그레시브 낭종 형성, 신장 확대 및 비정상적인 세관 (14)에 의해 발전을 특징으로한다. 상 염색체 우성 PKD (ADPKD)은 유전 질환 인 중 하나 PKD1의 돌연변이, polycystin-1 (PC1), 또는 PKD2를 인코딩 polycystin-2 (PC2)를 인코딩, 다낭성 신장의 결과. 다른 많은 유전자, 차 섬모에있는 단백질을 코딩 특히는, 신장 낭종의 개발…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (LH하는 DK093625 및 DK069909 및 DK047757 JHL에) NIH에서 지원하고, VA (우수상 JHL에 I01BX000820). 우리는 필수적인 지원을 제공하기 위해 펜실베니아 Zebrafish의 핵심 대학에서 박사 마이클 팩 박사 지에 그에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
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