En Mulig Sebrafisk Modell av Polycystisk Nyresykdom: knockdown av<em> Wnt5a</em> Årsaker Cyster i sebrafisk Nyrer

Summary

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

Sebrafisk (Danio rerio) embryoer har blitt mye brukt som modell for å studere nyre utvikling og polycystisk nyresykdom. Det er mange fordeler med å bruke sebrafisk som en dyremodell: muligheten for å studere genetiske interaksjoner, muligheten til å bruke antisense morpholinos (MO) for protein knockdown, muligheten til raskt å analysere et stort antall embryoer, og gleden over å vise organ fenotyper i levende larver ^en. De pronephros er den første nyre for å utvikle seg i virveldyr og er funksjonell i larvesebrafisk ^2. Strukturen av sebrafisk pronephros er forholdsvis enkel sammenliknet med pattedyr metanephros, til den tredje og siste nyre utvikles i pattedyr. Den nevronet er arbeidsenhet i nyrene, med hver human nyre inneholdende mellom ^3,4 og 500,000-1,000,000 nephrons hver mus nyre ha omtrent 13.000 nephrons ^5, noe som gjør det vanskelig å observere enkelt nevronet struktur In menneskelige eller mus nyrer. Sebrafisk har bare to nephrons, og hver sebrafisk nephron inneholder alle de viktigste komponentene som finnes i glomerulus og tubuli av mus og mennesker ⁶ og lignende spesialiserte nyrecelletyper. Sammenlignet med andre vertebrate modeller som Xenopus, mer ligner sebrafisk nevronet pattedyr nevronet, fordi den har et lukket system ^7.

I de senere årene har sebrafisk genom sekvensert, slik at den brede innføringen av genetiske verktøy, omfattende mutante ressurser og samlinger av transgene reporter linjer i sebrafisk modeller. Sebrafisk pronephros former mellom 12-72 timer etter befruktning (HPF) og kan visualiseres lett i de gjennomsiktige embryoer. Den Wilm tumor protein WT1 er en viktig faktor for nyre utvikling. Transgene sebrafisk linjer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av promoteren wt1b Tg (wt1b: GFP) viser GFP EXPREssion spesifikt lokalisert i pronephric regioner i sebrafisk embryo, fra 17 HPF ^8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk nyresykdom, er forårsaket av mutasjoner av NPHP gener ^9. NPHP4 knockdown etter morfolino forårsaket cystedannelse i Tg (wt1b: GFP). Fisk ¹⁰ Derfor er denne transgene fisken en egnet modell for å observere nyrestrukturer og cystedannelse under nyre utvikling. Viktigere, kan påvirkning av modulatorer av nyre utvikling studeres ved hjelp av denne stamme i en tids- og arbeidseffektiv måte.

Vår papir beskriver bruken av Tg (wt1b: GFP) fisk som modell for å visualisere nyre cyste formasjon etter genet modulering. Vi brukte start- og spleise-site anti-sense Mos å slå ned wnt5a genet i sebrafisk. Wnt5a er en ikke-kanoniske utskilt glykoprotein av Wnt familien som spiller en viktig rolle i utviklingen av ulike organer og postnatal mobilnettetfunksjon ^11. Wnt5a virker gjennom ikke-kanonisk wnt reaksjonsveier, inkludert den plane celle polaritet (PCP) veien, noe som har vist seg å spille en rolle i orientert celledeling under renal tubulær forlengelse. Wnt5a regulerer Wnt / PCP veien ved å danne et kompleks med reseptoren som tyrosin kinase (Ryk), noe som ytterligere transduces Wnt5a signalering ved å danne et kompleks med den VANGL plane celle polaritet protein 2 (Vangl2), for derved å fremme stabilitet Vangl2 ^12. Defekter i PCP pathway kan resultere i tilfeldig celledeling og forårsake nyre cyste formasjon. Vi brukte Tg (wt1b: GFP) sebrafisk linje å observere nyre cyste formasjon følgende wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) sebrafisk-modellen gjør levende avbildning og rettidig observasjon av nyre struktur. Etter wnt5a knockdown, ble nyre cyste formasjon funnet begynner ved 24 HPF; ved 72 HPF, kan cyster finnes i glomeruli og de proksimale tubuli. Denne metoden kunne også anvendes for å sCreen andre gener som kan forårsake nyre cyste formasjon.

Protocol

MERK: Etikk Uttalelse: Alle sebrafisk eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Eastern Virginia Medical School. 1. Morpholino Forberedelse Design og syntetisere oversettelse-blokkering (AUG-) og spleise-hemmer (Splice-) anti-sense morfolino- (MO) oligonukleotider for genet av interesse i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1A). Vennligst se produsentens informasjon i tabell 1. MERK: Mos sendes som frysetørrede aksje…

Representative Results

Wnt5a slå ned ble oppnådd ved å innføre oversettelse blokkere MO (august-MO) eller ekson / intron grensen spleise MO (spleise-MO) til sebrafisk embryo på én celle stadiet. AUG-MO rettet startkodonet og derfor hemmer både mors og zygotiske wnt5a melding. Skjøten-MO retter seg mot det tredje spleise donor området og hemmer bare zygotiske transkripsjon av wnt5a (figur 1A). Den AUG- og splice- morphants phenocopied hverandre med flere defekter, inkludert krøllete hale ned kroppen…

Discussion

Polycystisk nyresykdom (PKD) er en av de viktigste årsakene til end-stage renal sykdom hos mennesker og er preget av progressiv cyste formasjon, nedsatt utvidelse, og unormal tubule utvikling ^14. Autosomal dominant PKD (ADPKD) er en genetisk sykdom som mutasjon av enten PKD1, koding polycystin-1 (PC1), eller PKD2, koding polycystin-2 (PC2), resulterer i polycystiske nyrer. Mange andre gener, spesielt de som koder proteiner som finnes i den primære cilium, antas å være involvert i utviklingen av nyrecyster…

Materials

0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
Equipment
NanoDrop sepctrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop