We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Sebrafisk (Danio rerio) embryoer har blitt mye brukt som modell for å studere nyre utvikling og polycystisk nyresykdom. Det er mange fordeler med å bruke sebrafisk som en dyremodell: muligheten for å studere genetiske interaksjoner, muligheten til å bruke antisense morpholinos (MO) for protein knockdown, muligheten til raskt å analysere et stort antall embryoer, og gleden over å vise organ fenotyper i levende larver en. De pronephros er den første nyre for å utvikle seg i virveldyr og er funksjonell i larvesebrafisk 2. Strukturen av sebrafisk pronephros er forholdsvis enkel sammenliknet med pattedyr metanephros, til den tredje og siste nyre utvikles i pattedyr. Den nevronet er arbeidsenhet i nyrene, med hver human nyre inneholdende mellom 3,4 og 500,000-1,000,000 nephrons hver mus nyre ha omtrent 13.000 nephrons 5, noe som gjør det vanskelig å observere enkelt nevronet struktur In menneskelige eller mus nyrer. Sebrafisk har bare to nephrons, og hver sebrafisk nephron inneholder alle de viktigste komponentene som finnes i glomerulus og tubuli av mus og mennesker 6 og lignende spesialiserte nyrecelletyper. Sammenlignet med andre vertebrate modeller som Xenopus, mer ligner sebrafisk nevronet pattedyr nevronet, fordi den har et lukket system 7.
I de senere årene har sebrafisk genom sekvensert, slik at den brede innføringen av genetiske verktøy, omfattende mutante ressurser og samlinger av transgene reporter linjer i sebrafisk modeller. Sebrafisk pronephros former mellom 12-72 timer etter befruktning (HPF) og kan visualiseres lett i de gjennomsiktige embryoer. Den Wilm tumor protein WT1 er en viktig faktor for nyre utvikling. Transgene sebrafisk linjer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av promoteren wt1b Tg (wt1b: GFP) viser GFP EXPREssion spesifikt lokalisert i pronephric regioner i sebrafisk embryo, fra 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk nyresykdom, er forårsaket av mutasjoner av NPHP gener 9. NPHP4 knockdown etter morfolino forårsaket cystedannelse i Tg (wt1b: GFP). Fisk 10 Derfor er denne transgene fisken en egnet modell for å observere nyrestrukturer og cystedannelse under nyre utvikling. Viktigere, kan påvirkning av modulatorer av nyre utvikling studeres ved hjelp av denne stamme i en tids- og arbeidseffektiv måte.
Vår papir beskriver bruken av Tg (wt1b: GFP) fisk som modell for å visualisere nyre cyste formasjon etter genet modulering. Vi brukte start- og spleise-site anti-sense Mos å slå ned wnt5a genet i sebrafisk. Wnt5a er en ikke-kanoniske utskilt glykoprotein av Wnt familien som spiller en viktig rolle i utviklingen av ulike organer og postnatal mobilnettetfunksjon 11. Wnt5a virker gjennom ikke-kanonisk wnt reaksjonsveier, inkludert den plane celle polaritet (PCP) veien, noe som har vist seg å spille en rolle i orientert celledeling under renal tubulær forlengelse. Wnt5a regulerer Wnt / PCP veien ved å danne et kompleks med reseptoren som tyrosin kinase (Ryk), noe som ytterligere transduces Wnt5a signalering ved å danne et kompleks med den VANGL plane celle polaritet protein 2 (Vangl2), for derved å fremme stabilitet Vangl2 12. Defekter i PCP pathway kan resultere i tilfeldig celledeling og forårsake nyre cyste formasjon. Vi brukte Tg (wt1b: GFP) sebrafisk linje å observere nyre cyste formasjon følgende wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) sebrafisk-modellen gjør levende avbildning og rettidig observasjon av nyre struktur. Etter wnt5a knockdown, ble nyre cyste formasjon funnet begynner ved 24 HPF; ved 72 HPF, kan cyster finnes i glomeruli og de proksimale tubuli. Denne metoden kunne også anvendes for å sCreen andre gener som kan forårsake nyre cyste formasjon.
Polycystisk nyresykdom (PKD) er en av de viktigste årsakene til end-stage renal sykdom hos mennesker og er preget av progressiv cyste formasjon, nedsatt utvidelse, og unormal tubule utvikling 14. Autosomal dominant PKD (ADPKD) er en genetisk sykdom som mutasjon av enten PKD1, koding polycystin-1 (PC1), eller PKD2, koding polycystin-2 (PC2), resulterer i polycystiske nyrer. Mange andre gener, spesielt de som koder proteiner som finnes i den primære cilium, antas å være involvert i utviklingen av nyrecyster…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH (DK093625 til LH, og DK069909 og DK047757 til JHL) og VA (Merit Award I01BX000820 til JHL). Vi ønsker å takke Dr. Michael Pack og Dr. Jie Han ved University of Pennsylvania Sebrafisk Kjerne for å gi nødvendig støtte.
0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
Equipment | |||
NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |