En möjlig Zebrafish Modell av polycystisk njursjukdom: Knockdown av<em> Wnt5a</em> Orsaker Cystor i Zebrafish Njurar
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) embryon har använts i stor utsträckning som en modell för att studera njurutveckling och polycystisk njursjukdom. Det finns många fördelar med att använda zebrafisk som en djurmodell: möjligheten att studera genetiska interaktioner, förmågan att använda antisense morpholinos (MO) för proteinknockdown, en möjlighet att snabbt analysera ett stort antal embryon, och hur lätt visning fenotyper organ i levande larver 1. De pronephros är den första njuren att utvecklas hos ryggradsdjur och är funktionell i larvzebrafisk 2. Strukturen hos zebrafisk pronephros är relativt enkel jämfört med de däggdjurs metanefros, till den tredje och sista njure utvecklas i däggdjur. Nefronet är arbetsenheten i njuren, med varje människa njure innehåller mellan 500,000-1,000,000 nephrons 3,4 och varje mus njure har cirka 13.000 nephrons 5, vilket gör det svårt att observera enstaka nefronet struktur in mänskliga eller mus njurar. Den zebrafisk har bara två nephrons, och varje zebrafisk nefronet innehåller alla viktiga komponenter som finns i glomerulus och tubuli av möss och människor 6 och liknande specialiserade njurcelltyper. Jämfört med andra ryggradsdjur modeller såsom Xenopus, zebrafisk nephron mer liknar däggdjurs nefronet eftersom den har ett slutet system 7.
Under de senaste åren har den zebrafisk genomet sekvenserats, vilket gör den breda introduktionen av genetiska verktyg, omfattande resurser mutant, och samlingar av transgena reporter linjer i zebrafisk modeller. Zebrafisk pronephros bildas mellan 12-72 h efter befruktning (HPF) och kan visualiseras lätt i de transparenta embryon. Den Wilms tumör protein WT1 är en viktig faktor för njurutveckling. Transgena zebrafisk linjer som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av wt1b promotorn Tg (wt1b: GFP) visar GFP expression specifikt beläget i pronephric regioner zebrafiskembryon, från 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), en autosomal recessiv cystisk njursjukdom, orsakas av mutationer i NPHP gener 9. NPHP4 knockdown genom morfolino orsakade cystbildning i Tg (wt1b: GFP). Fisk 10 Därför är denna transgen fisk en lämplig modell för att observera njurstrukturer och cystbildning under njurutveckling. Viktigt kan studeras påverkan av modulatorer av njure utveckling med denna stam i ett tids- och arbetseffektivt sätt.
Vårt papper beskriver användningen av Tg (wt1b: GFP) fisk som en modell för att visualisera njur cystbildning efter gen modulation. Vi använde start- och skarv-site antisens MO att slå ner wnt5a genen i zebrafisk. Wnt5a är en icke-kanoniska utsöndrade glykoproteinet i Wnt familjen som spelar en viktig roll i utvecklingen av olika organ och postnatal cellulärfunktion 11. Wnt5a fungerar genom icke-kanoniska Wnt vägar, däribland den plana cellpolaritet (PCP) väg, vilket har visat sig spela en roll i orienterat celldelning under renal tubulär förlängning. Wnt5a reglerar Wnt / PCP-vägen genom att bilda ett komplex med receptorn liknande tyrosinkinas (Ryk), som ytterligare omvandlar Wnt5a signalering genom bildning av ett komplex med VANGL plana cellpolaritet protein 2 (Vangl2) och därigenom främja Vangl2 stabilitet 12. Defekter i PCP vägen kan resultera i slumpmässig celldelning och orsaka njur cystbildning. Vi använde Tg (wt1b: GFP) zebrafisk linje att observera njur cystbildning efter wnt5a knockdown. Tg (wt1b: GFP) zebrafisk modellen möjliggör levande avbildning och snabb observation av njurstrukturen. Efter wnt5a knockdown, var njur cystbildning hittat början vid 24 HPF; vid 72 HPF, kunde cystor hittas i glomeruli och proximala tubuli. Denna metod kan också användas för att sCreen andra gener som kan orsaka njur cystbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polycystisk njursjukdom (PKD) är en av de främsta orsakerna till slutstadiet njursjukdom hos människor och kännetecknas av progressiv cystbildning, njur utvidgningen, och onormal tubuli utveckling 14. Autosomalt dominant PKD (ADPKD) är en genetisk sjukdom där mutation av antingen PKD1, kodning polycystin-1 (PC1), eller PKD2, kodning polycystin-2 (PC2), resulterar i polycystiska njurar. Många andra gener, särskilt de som kodar för proteiner som finns i den primära cilium, tros vara inblandade i utvec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH (DK093625 till LH och DK069909 och DK047757 till JHL) och VA (Merit Award I01BX000820 till JHL). Vi vill tacka Dr Michael Pack och Dr Jie Han vid University of Pennsylvania Zebrafish Kärna för att ge viktigt stöd.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
