Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de Wnt5a Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Summary

Descrevemos um método de geração de um possível modelo de peixe-zebra de doença renal policística. Usamos peixes Tg(wt1b:GFP) para visualizar a estrutura renal. O knockdown de wnt5a foi por injeção de morfolino. A formação de cistos pronéfricos após o knockdown de wnt5a foi observada neste peixe-zebra transgênico GFP.

Abstract

A doença renal policística (PKD) é uma das causas mais comuns de doença renal terminal, uma doença devastadora para a qual não há cura. Os mecanismos moleculares que levam à formação de cistos na PKD permanecem um tanto obscuros, mas acredita-se que muitos genes estejam envolvidos. Wnt5a é uma glicoproteína não canônica que regula uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Wnt5a funciona através da via de polaridade celular planar (PCP) que regula a divisão celular orientada durante o alongamento das células tubulares renais. Descobriu-se que defeitos da via PCP causam a formação de cistos renais. Nosso artigo descreve um método para desenvolver um modelo de doença renal cística de peixe-zebra por knockdown do gene wnt5a com oligonucleotídeos wnt5a antisense morfolino (MO). O peixe-zebra transgênico Tg(wt1b:GFP) foi usado para visualizar a estrutura renal e os cistos renais após o knockdown de wnt5a. Dois MOs antisense distintos (AUG - e splice-site) foram usados e ambos resultaram em fenótipo de cauda encaracolada e formação de cistos após o knockdown de wnt5a. A injeção de mRNA Wnt5a de camundongo, resistente aos MOs devido a uma diferença na estrutura do par de bases primárias, resgatou o fenótipo anormal, demonstrando que o fenótipo não foi devido a efeitos "fora do alvo" do morfolino. Este trabalho apóia a validade do uso de um modelo de peixe-zebra para estudar a função wnt5a no rim.

Introduction

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos ¹ larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval ^2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente sim....

Protocol

Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School.

1. Preparação Morpholino

1. Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.
   NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro.
2. Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspen....

Results

Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múltiplos, incluind.......

Discussion

Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo ^14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas que se encontram.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% Fenol-Vermelho	Sigma	P0290	Indicador de cor para injeção
Morpholino	Genn Tools, LLC	(personalizado)	Personalizado projetado para o gene de interesse
Agulha pré-puxada	Tritech Research	MINJ-PP	Se for necessária uma grande quantidade de agulha, você também pode comprar um extrator de agulha e preparar a agulha no laboratório
Kit T7 mMessage	Ambion	1344	Para transcrição in vitro para fazer mRNA tampado para experimento de resgate
N-Feniltioureia	Sigma	P7629	Para prevenção de melanização
Tricaine	Sigma	A5040	Também chamado de etil 3-aminobenzoato, para anestesia de peixe-zebra
Metilcelulose	Sigma	M-0387	Para posição de peixe-zebra
Kit de Purificação PCR QIAquick	Qiagen	28104	Para purificação de produto de PCR para síntese de RNA cap.
Mistura Promega		U1511	do dNTP para a
polimerase	Invitrogen	10342-053	para
o espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND-1000	NanoDrop para o morpholino da medida e a concentração do RNA
Compressor de ar	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Fonte de ar para injeção
Bomba de microinjeção Pico	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Outros tipos de sistema de microinjeção podem ser usados.
Micro-fabricante	World Precision Instruments Inc	MMJR	Destro (MMJL para canhotos)
Suporte de agulha	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	Para segurar agulha para micromanipulação
Dumont Pinças	Cirúrgicas Finas	Ferramentas 11253-20	Para quebrar a ponta da agulha
Microscópio de dissecação	Leica M205C		Para observação e imagem de embriões de peixe-zebra
Microscópio de fluorescência	Zeiss Axio Obserer D1m		Para imagens de peixe-zebra pronephros
Tubo capilar (ID 0,15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	Para medir o volume de cada gota injetada