Intakta klass I HLA / peptidkomplex fälls av cancerceller, vilket motsvarar en potentiell relevant cancer biomarkör. Använda märkningsfri sensorteknik och T-cellreceptor mimicking monoklonala antikroppar, detektion av skjul MIF / HLA-A * 02: 01 komplex i MDA-MB-231-cellsupernatanter, spetsade humanserum, och patientplasma demonstreras, vilket möjliggör utveckling av en roman cancer diagnostisk plattform.
Enligt American Cancer Society, kommer mer än 200.000 kvinnor diagnostiseras med invasiv bröstcancer varje år och cirka 40.000 kommer att dö av sjukdomen. Den mänskliga leukocytantigen (HLA) klass I prover peptider härledda från proteasomal nedbrytning av cellulära proteiner och presenterar dessa fragment på cellytan för förhör genom cirkulerande cytotoxiska T-lymfocyter (CTL). Generering av T-cellreceptor härmare (TCRm) monoklonala antikroppar (mAbs) som känner igen bröstcancer specifik peptid / HLA-A * 02: 01 komplex, såsom de som härrör från migration av makrofager inhiberande faktor (MIF 19-27) och NY-ESO- 1 157-165 möjliggör upptäckt och förstörelse av bröstcancerceller i avsaknad av en effektiv anti-tumör CTL-svar. Intakta klass I HLA / peptidkomplex fälls av bröstcancerceller och representerar potentiellt relevanta cancer biomarkörer. I detta arbete, ett genombrott biomarkör screening system för cancer diagnostiks införliva T-cellreceptor mimic monoklonala antikroppar i kombination med en roman, märkningsfri biosensor utnyttjar guidad-modsresonans (GMR) sensorteknik presenteras. Detektering av skjul MIF / HLA-A * 02: 01 komplex i MDA-MB-231-cellsupernatanter, spetsade humanserum, och patientplasma demonstreras. Effekterna av detta arbete skulle kunna revolutionera personlig medicin genom utveckling av diagnostik följeslagare sjukdoms för riktade immunterapier.
De klass I HLA-antigen (HLA) Prover peptider av 8-11 aminosyror i längd härledda från proteasomal nedbrytning av det intracellulära proteinet repertoar och presenterar dessa peptider på ytan av varje kärnförsedd cell 1,2. HLA-komplex är "naturens biomarkör", vilket indikerar att hälsa varje cell (Figur 1) till cirkulerande cytotoxiska T-lymfocyter (CTL). Erkännande av sjukdom associerad peptider leder eliminering av den felande cellen genom CTL. Således är det adaptiva immunsvaret mycket effektiv på att eliminera viral infektion och tumör. Men utövar immunsystemtryck som ofta främjar val för virus eller tumör som kan kringgå en effektiv CTL respons. T-cellreceptor mimicking (TCRm) monoklonala antikroppar (mAbs) som känner igen specifika peptid / HLA-A * 02: 01 komplex, såsom de som är härledda från bröstcancer associerade proteiner, migration av makrofager inhiberande faktor (MIF19-27) 3 och NY-ESO-1 157-165, möjliggör upptäckt och förstörelse av bröstcancerceller i avsaknad av en effektiv anti-tumör CTL-svar 4,5. Denna representativa arbete är inriktat på HLA-A * 0201-molekyl, som uttrycks med upp till 30% av befolkningen. Men identifieringen av andra relevanta HLA / peptidkomplex, följt av produktionen av TCRm möjliggör utvecklingen av riktade immunterapier och diagnostik följeslagare sjukdom, utöka nyttan av detta arbete till en mycket bredare population.
En del av peptiden / HLA-komplexen bundna till cellytan frisätts in i plasman. På grund av den mycket komplicerade karaktären av peptid / HLA pooler, nuvarande metoder för gruvdrift immunopeptidome för HLA associerade biomarkörer är tidskrävande. Denna process kräver att affinitetsrening av lösligt HLA från plasma, separation av HLA associerade peptider genom omvänd fas högtrycksvätskekromatografi(RP-HPLC) och peptid sekvense med tandem masspektrometri (MS / MS) 6,7. Även om denna process är ett gångbart alternativ för upptäckten av nya terapeutiska mål, det är en besvärlig process som sällskap diagnostiskt verktyg för HLA tillhörande mål redan i den terapeutiska vaccin eller biofarmaceutiska rörledning 8-10. TCRm riktad mot dessa mål ger verktygen för snabb följeslagare diagnostisk utveckling som syftar till att stratifiera patienter i relevanta kliniska prövningar och ge mer välgrundade terapeutiska alternativ.
I detta arbete är ett genombrott biomarkör screening system för cancerdiagnostik presenteras som utnyttjar TCRm och en etikett fritt bioassay system som övervakar biologiska interaktioner med minimala processteg. Etiketten fria bioanalys-systemet bygger på en metod, som utnyttjar den guidade-modsresonans (GMR) verkan som inträffar i dielektriska vågledargitter 11-14. När bredbandsljus kontakt med diffraktivarivning i plattorna som erfordras för detta system, är två specifika våglängder reflekteras. Den bindningsinteraktionen mellan en immobiliserad receptor och dess ligand övervakas i realtid genom att spåra resonansvåglängdsförändring med en spektrumanalysator 12. Separata resonanstoppar uppstå av incident TE (elektrisk vektor normal till planet infalls) och TM (magnetiska vektor normal till planet infalls) polarisationstillstånden ger flera datapunkter som potentiellt kan öka upptäckt noggrannhet 11,14. Användning av antikropp pre-sensibiliserade plattorna i denna etikett fritt analyssystem, tidsanalyskörning med dataanalys är ca 45 min. Dessutom kan flera patientprover avfrågas i en 96- eller 384-brunnsformat, en klar fördel gentemot en HPLC-MS / MS-baserat format.
Den metod som beskrivs häri introducerar en biomarkör screening system för cancerdiagnostik som skulle möjliggöra snabb detektion av lösliga peptid / HLA-komplex i patientens serum, plasma, urin eller salivprov i en hög genomströmning 96- eller 384-väl format. Detta analyssystem som använder T-cellreceptor mimicking monoklonala antikroppar och en märkning fritt detekteringssystemet skär analystiden till mindre än en timme jämfört med 3,5 timmar med konventionell ELISA. Denna hög genomströmning tillvägagångssätt möjliggör snabb skiktning av patienter till kliniska prövningar för terapeutiska cancervacciner eller proteinläkemedel. Nuvarande metoder för detektion av dessa mål sjukdoms kräver affinitetsrening och HPLC-MS / MS enskilda patientprover, ett besvärligt och tidskrävande process. Även om denna metod är mottaglig för konventionella ELISA-tekniker, det finns oro för att sekundära detektionsreagens såsom anti-β2 mikroglobulin antikropp kan förändra strukturen på begynnande HLEn molekyl och hämmar bindning till TCRm begränsande upptäckt. Etikett-detektering minskar dessa bekymmer. Detta förfarande kan modifieras för användning på andra märkningsfria system såsom en ytplasmonresonans-system. Emellertid skulle detta i hög grad minska de högre genomströmningskapacitet jämfört med bioassay system som används i denna studie.
Detta protokoll kan effektivt modifieras för detektion av icke-HLA biomarkörer i patientserum och plasma med vidhäftning till några kritiska steg. Övervakning av den initiala antikroppbeläggningsprocessen rekommenderas för optimering av ytan, som en <200 pm förskjutning kommer sannolikt att resultera i låg signal för det efterföljande steget detektering. Baslinjen och eftertvätt läser är användbara för ändpunktsanalys som överflödet av serumproteiner kan maskera bindning av låg koncentration analyt. Slutligen kan temperaturvariation av prover resultera i brunn till brunn variation. Det rekommenderas att alla prover förinkuberas end etiketten fria biosassay enhet temperaturregulator ställas in på 2-3 ° C över rumstemperatur. Kylda prov bör få tillräckligt med tid för att nå arbetstemperatur.
Framtida ändringar av detta protokoll kommer att omfatta multiplexering av TCRm på plåtytan. Bioanalysen systemet för närvarande är mottaglig för spotting av brunnar vid en densitet av åtminstone 8-Plex. Genom att införa 4-8 TCRm till varje brunn, per provprovvolymer minskar och möjliggör insamling av allt mer komplexa data per patient. Denna förmåga kan ytterligare informera patienter när det gäller behandlingsalternativ.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |