Mus nyretransplanterte: Modeller av allograft-avstøting

Summary

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Abstract

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Introduction

Vellykket nyretransplantasjon for behandling av nyresvikt ble først beskrevet i 1955 mellom eneggede tvillinger ^1, siden da har det blitt en revolusjonerende behandling for pasienter med terminal nyresvikt i hele verden, og tilbyr både forbedring i lengde og livskvalitet ^to. Men langsiktig graft overlevelse har vært hemmet av en rekke patologiske prosesser som resulterer i kronisk allograft skade ^tre.

Avvisning av transplantert nyre hos mennesker er fortsatt en viktig årsak til sykelighet, til tross for betydelige forbedringer i immunosupporessive regimer. Sikte på å utvikle en musemodell for nyretransplantasjon er å nøye replikere prosessen og patologi funnet i menneskelig nyretransplantasjon ^fire. Skoskiewicz et al. Først beskrev musemodell for nyretransplantasjon i 1973 ^fem. Selv avanserte mikrokunnskaper er nødvendig, er det en verdifull tOOL av flere grunner: musen genomet har blitt godt karakterisert og det er et stort utvalg av eksperimentelle metoder og teknikker tilgjengelig for musestudier.

Mange grupper ved hjelp av musemodell for nyretransplantasjon har brukt den transplanterte nyre som et livsunderstøttende organ, men i andre studier og i vår beskrevne metodikk en av mottakerens mus har native nyrer er igjen in situ for varigheten av eksperimentet ^4. Fordelen er at musen gjennomgår en enkelt anestesi og operasjon og dermed redusere sykelighet til musen og risikoen for å dø av en annen prosedyre. I tillegg musen ikke lider av de negative virkningene av gradvis nyresvikt.

Selv om modeller av allogen avvisning eksistere i andre organer som hjerte og hud, disse er ikke alltid direkte relevant for nyretransplantasjon. Det er dokumentert at disse modellene lokke fram ulike moduser og dydynamikk for avvisning, for eksempel den tiden løpet av avvisning i hjerte allograft og renal allograft skiller seg vesentlig i visse belastningskombinasjoner ^seks. Vi har beskrevet akutte nyre allograft avvisning mønstre i BALB / c givere til ikke-transgene FVB / NJ mus, denne modellen viste cellular mediert skade med opphopning av T-celler og makrofager ^7. Alternativt har vi også beskrevet en modell av kronisk allograft skade som viser interstitiell fibrose og tubulær atrofi, dette resulterer fra transplantere en nyre fra C57BL / 6 ^BM12 givere inn C57BL / 6 mottakere, som disse musene er preget av en enkelt MHC klasse II loci mis -match ^åtte.

Flere aspekter av transplantasjon har blitt studert ved hjelp av musemodell for nyretransplantasjon inkludert akutt avvisning, cellulær og humoral avvisning, iskemi reperfusjonsskade, og trialing nye terapeutiske midler. Vi har endret den kirurgiske technique å redusere driftstiden og forbedre den enkle operasjonen. Spesielt har vi beskrevet samtidig giver og mottaker preparatet og en forenklet vaskulær anastomose teknikk ved å benytte en kontinuerlig aorta patch anastomose. Denne videoen og manuskript vil gi viktige poeng til hjelp i etableringen av denne teknikken.

Protocol

Egnede nasjonale og lokale institusjonelle etikk bør være på plass før du utfører dyreforsøk. Spesielt i Storbritannia de følgende forsøk ble foretatt under Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 Hvor to microsurgeons er tilgjengelig for å operere samtidig giver kirurg skal utføre trinn 1,1 til 1,16 og deretter 3,1 til 3,5, mens mottakeren kirurgen utfører 2.1-2.8 . For en enkelt operatør fremgangsmåten kan følges sekvensielt. 1. Donor Forberedelse …

Representative Results

Nedsatt allograft avvisning kan vurderes ved histologisk analyse av methacarn-fast parafininnstøpte vevssnitt av transplantert nyre (figur 2). Isograft transplantasjon av nyrer mellom syngene muse resulterer i nedsatt iskemisk reperfusjonsskade, men etter 4 uker tubuli har gjenvunnet og er histologisk sammenlignes med innfødte nyrer. Akutt avvisning kan modelleres ved C57BL / 6 nyretransplantasjon inn BALB / c mottakere, innen 1 uke er det diffuse mononukleære celleinfiltrasjon gjennom nyreparenchyme…

Discussion

Den mest beskrevne måte for å utføre den arterielle anastomose er å bruke den distale aorta av donor, med den renale arterie i forlengelse, i en ende-til-side-måte til mottakeren aorta. Vi beskriver bruk av en aorta patch, ligner på 'Carrell patch' speiling som utføres i menneskelig nyretransplantasjon som vi mener er mer praktisk. Selv om rapporter i litteraturen av giver og mottaker operative tid er sparsom tror vi at å benytte en aortic patch til mottaker aorta i stedet for ende-til-side donor aorta t…

Materials

			Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10	For skin cutting
Curved Castoviejo scissors	Fine Science Tools	15017-10	For tissue cutting
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-08	For suture cutting
Toothed forceps 1×2 teeth	Fine Science Tools	11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5)	Fine Science Tools	11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45)	Fine Science Tools	11253-25	For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7)	Fine Science Tools	11273-22	Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat	Fine Science Tools	1300-04
Micro clip applicator with lock	Fine Science Tools	18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm	Fine Science Tools	18055-04	Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	120660-01
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07	Remove 7 to 10 days after surgery
			Equipment
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Thermal cautery unit with fine tip	Geiger	150A
Heat electronic pad	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
			Disposable equipment
7/O Silk braided suture	Pearsall	30514
10/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1118099
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Insulin needle 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Insulin needle 0.3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	300184
5 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	302187
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	sterilised by autoclave
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	sterilised by autoclave
Plain drapes	Guardian	CB03	sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm	Corning Incorporated	430166
Dispensing Pin	B-Braun	DP3500L / 413501	Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution	Belzer Bridge to Life	n/a	dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323
Heparin Sulphate	non-proprietary	n/a	5000units/ml (dose 5units/mouse)