Atomic Force Mikroskopi av Red-Light Fotoreseptorer Bruke PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Eiendoms Mapping
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) bruker en pyramideformet spiss festet til en konsoll for å undersøke styrken respons av en overflate. De nedbøyninger av spissen kan måles til ~ 10 pN av en laser og sectored detektor, som kan omdannes til bilde topografi. Amplitudemodulasjon eller "tappe mode" AFM omfatter sonden slik intermitterende kontakt med overflaten samtidig som oscillerer med sin resonans frekvens for å frembringe et bilde. Brukt i forbindelse med en fluidcelle, gjør det mulig å tappe-modus AFM avbildning av biologiske makromolekyler, for eksempel proteiner i fysiologisk relevante betingelser. Tappe-modus AFM krever manuell innstilling av sonden og hyppige justeringer av et mangfold av skanningsparametere som kan være utfordrende for uerfarne brukere. For å få bilder av høy kvalitet, disse justeringene er den mest tidkrevende.
PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Eiendom Mapping (PF-QNM) produserer et bilde ved å måle en kraft response kurve for hvert kontaktpunkt med prøven. Med ScanAsyst programvare, kan PF-QNM være automatisert. Denne programvaren justerer set-point, drive frekvens, scan rate, gevinster, og andre viktige skanningsparametere automatisk for en gitt prøve. Ikke bare gjør dette prosessen beskytte både skjøre prober og prøver, reduserer den tiden som kreves for å få bilder med høy oppløsning. PF-QNM er kompatibel for AFM bildebehandling i væsken; Det har derfor bred anvendelse for avbilding av biologisk relevante materialer.
Metoden som presenteres i dette notatet beskriver anvendelsen av PF-QNM å få bilder av en bakteriell red-light fotoreseptoren, RpBphP3 (P3), fra fotosyntese R. palustris i sitt lys-tilpasset tilstand. Ved hjelp av denne metode, har individuelle protein dimerer av P3 og aggregater av dimerer er observert på et mica overflate i nærvær av en bildebuffer. Med nødvendige justeringer til overflaten og / eller løsning konsentrasjon, denne metodenkan generelt anvendes på andre biologisk relevante makromolekyler og myke materialer.
Introduction
Atomic force microscopy (AFM) er blitt et meget viktig hjelpemiddel for å undersøke de strukturelle og mekaniske egenskaper av overflater, tynne filmer, og enkle molekyler siden den foreliggende oppfinnelse i 1986 (figur 1). 1-3 Ved hjelp av en væske-celle, har metoden blir spesielt nyttig for studier av biologiske makromolekyler og med levende celler i et fysiologisk relevant miljø. 4-10 Tapping-modus AFM har tradisjonelt blitt brukt for å avbilde myke materialer eller løst bundne molekyler til overflaten, ettersom kontakt-modus AFM er vanligvis uegnet på grunn til skaden forårsaket av sidekrefter som virker på prøven ved cantilever. 11 Tapping-modus AFM reduserer vesentlig disse kreftene ved å ha spissen periodevis berøre overflaten heller enn å være i konstant kontakt. I denne modus blir cantilever oscilleres ved eller nær dens resonansfrekvens normalt til overflaten. Tilsvar å kontakte-modus AFM, er topografi analyzed ved å plotte bevegelse av z-piezo som en funksjon av xy (avstand).
De uthengende dynamikk kan være ganske ustabile ved eller i nærheten av resonans; derfor er de svært utfordrende å automatisere utenfor en "steady-state" situasjon. Nærmere bestemt er disse dynamikken avhenge både av de eksempel egenskaper og scanning miljø. For en myk molekyl adsorbert til en hard (eh) overflate, kan et godt avstemt tilbakekoblingssløyfe for molekylet fører til tilbakesvingningen til overflaten. Drift i væske ytterligere kompliserer tuning av cantilever. Endringer i temperatur eller væskenivåer krever konstant omstilling av settpunkt, gevinster, og andre bildebehandlingsparametere. Disse justeringene har en tendens til å være svært tidkrevende og utfordrende for brukerne.
Peak Force Kvantitativ Nanomechanical Eiendom Mapping (PF-QNM), som å banke modus AFM, unngår lateral interaksjoner ved periodisk kontakte prøven (figur 2). 12-15 </ Sup> Men opererer PF-QNM i ikke-resonant modus og frekvenser mye lavere enn å tappe-modus AFM. Dette eliminerer innstiller utfordringene ved å tappe-modus AFM, spesielt de som er forsterket av tilstedeværelsen av fluid. Med PF-QNM, vil bildene samlet ved å ta en kraft responskurve på hvert kontaktpunkt. Med tillegg av ScanAsyst programvare, kan 15 justering av skanneparametere automatiseres og et bilde med høy oppløsning oppnådd i løpet av minutter etter selv uerfarne brukere. Når brukeren blir mer kjent med AFM, kan noen eller alle av de automatiserte parametere deaktiveres til enhver tid som tillater experimentalist å fininnstille bildekvaliteten manuelt. Siden begynnelsen, har PF-QNM blitt brukt for å kartlegge bacteriorhodopsin, en membran protein, og andre innfødte proteiner på submolecular nivå. 16-18 For bacteriorhodopsin, det er en direkte sammenheng mellom protein fleksibilitet og X-ray krystallografiske strukturer. 12 PF -QNM blitt anvendt for å undersøke levende celler med høy oppløsning. 19,20 Videre er PF-QNM data belyst viktige forbindelser mellom struktur og mekanikken i erytrocytt-membran som er kritisk for celleintegritet og funksjon. 21.
Vi har ansatt scanning probe mikroskopi (SPM) metoder, 22 inkludert AFM, 23 til å studere strukturen av red-light fotoreseptorer kalt bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består av en lys sensing modul kovalent bundet til et signal-effektor modul slik som histidin kinase (HK). 26. Lyset følermodulen inneholder typisk en Bilin kromofor som gjennomgår en strukturell transformasjon ved absorpsjon av et foton med en rekke strukturelle endringer som når signale-effektor-modul og som fører til en global transformasjon av hele proteinet . 24,27-29 Basert på denne transformasjonen, er det to distinkte lysabsorberende sTates av BphPs, en rød og langt rødt lys absorberende tilstand, betegnet som Pr og PFR. Pr er termisk stabile, mørk-tilpasset tilstand for de fleste BphPs. 28 Den molekylære grunnlaget for Pr / PFR photoconversion er ikke helt forstått på grunn av begrenset strukturell kunnskap om disse proteinene. Med unntak av en struktur fra D. radiodurans, 30 alle publiserte røntgen krystallografiske strukturer av disse proteinene er i mørket-innrettet tilstand, og mangler effektor domenet. De intakte BphPs er for store til å være effektivt undersøkt ved kjernemagnetisk resonans (NMR) og er notorisk vanskelig å krystallisere i sin intakte form (særlig i lys-innrettet tilstand) for røntgenkrystallografi. BphPs har nylig blitt utviklet som infrarød fluorescerende protein markører (IFP-tallet). 31 strukturell karakterisering av disse proteinene kan ytterligere hjelp i effektiv IFP design. 32-36
Fokus for denne artikkelen er å presentere en prosedyre foravbildning av BphPs med flytende-celle AFM via PF-QNM. Fremgangsmåten er vist ved studier av lys-innrettet tilstand av bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) fra den fotosyntetiske bakterien R. palustris. AFM prosedyren som presenteres her er praktisk og grei tilnærming for avbildning av proteiner samt andre biologiske makromolekyler. Med denne metoden kan strukturelle detaljer av individuelle molekyler samles i en kort tid, tilsvarende et øvre nivå science selvfølgelig laboratorie sesjon. Gjennom måling av tverrsnitt og fullføre ytterligere dimensjonale analyser, kan eksperimentelle data sammenlignes med nyttige beregningsmodeller. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM er et skanning mikrosonde metode fullt ut i stand til å avbilde proteiner og andre biologiske makromolekyler i fysiologisk relevante betingelser. I forhold til røntgen-krystallografi og NMR, er en begrensning av AFM sin manglende evne til å oppnå den samme oppløsning, spesielt lateral oppløsning. Ved bruk av AFM å analysere et molekyl på en hvilken som helst overflate, må virkningen av overflaten og sonden på bildet av molekylet også tas i betraktning når data analyseres. Deconvoluting av sonden innvirkn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF-MR program (CHE: 1229103) er anerkjent for å finansiere kjøp av nye styringselektronikk, programvare, flytende celler, og annet utstyr som trengs for å montere en dual AFM / STM. Vi erkjenner de felles fasilitetene på The University of Chicago NSF-MRSEC program (DMR-0820054) for å få hjelp med AFM instrumentering, opplæring og bildebehandling, og for instrument tid gjort tilgjengelig av Materials Research fasiliteter Network (DMR-0820054). Vi takker spesielt Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, og professor Ka Yee Lee for våre studenter inn før finansieringen av NSF-MR forslag som brakte den nødvendige instrumentering til vår campus. Vi erkjenner midler fra en avdeling III STEM stipend (ID: P031C110157) tildelt Northeastern Illinois University som ga sommerforskningsstipend for studenter og lærere, samt støtte for forbruksartikler. Til slutt, vi erkjenner Bruker-Nano, Inc. for fortsatt instrumental støtte og for tillatelse til å reproduce et plott som viser mekanismen for PeakForce QNM og å bruke ordet ScanAsyst å beskrive den automatiserte programvare.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
Referências
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
