Microscopia de Força Atômica da Red-Light fotorreceptores Usando Mapeamento PeakForce Quantitative nanomecânicos Propriedade
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Microscopia de força atômica (AFM) usa uma ponta piramidal anexado a um cantilever para sondar a resposta força de uma superfície. Os desvios de ponta pode ser medido para ~ 10 pN por um detector de laser e dividida em sectores, que pode ser convertido em imagem topografia. Modulação de amplitude ou AFM "modo de tocar" envolve a sonda fazer contato intermitente com a superfície, enquanto oscilando em sua freqüência de ressonância para produzir uma imagem. Usado em conjunto com uma célula de fluido, tocando-AFM modo permite a imagiologia de macromoléculas biológicas, tais como proteínas em condições fisiologicamente relevantes. Tocar de modo AFM requer sintonia manual da sonda e ajustes frequentes de uma infinidade de parâmetros de verificação que pode ser um desafio para usuários inexperientes. Para obter imagens de alta qualidade, esses ajustes são mais demoradas.
PeakForce Quantitative nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM) produz uma imagem medindo a respon vigorcurva se para cada ponto de contato com a amostra. Com o software ScanAsyst, PF-QNM pode ser automatizado. Este software ajusta o set-point, a frequência da unidade, taxa de varredura, os ganhos, e outros parâmetros de digitalização importantes automaticamente para uma determinada amostra. Não só este processo de proteger ambas as sondas frágeis e amostras, que reduz significativamente o tempo necessário para obter imagens de alta resolução. PF-QNM é compatível para imagens AFM de fluido; portanto, ele tem uma vasta aplicação para geração de imagens materiais biologicamente relevantes.
O método apresentado neste artigo descreve a aplicação de PF-QNM para obter imagens de uma bacteriana fotorreceptor da luz vermelha, RpBphP3 (P3), a partir da fotossíntese R. palustris no seu estado adaptado luz. Usando este método, os dímeros de proteínas individuais de P3 e agregados de dímeros foram observados sobre uma superfície de mica na presença de um tampão de imagens. Com os ajustes apropriados para a superfície e / ou concentração da solução, este métodopode ser geralmente aplicada a outras macromoléculas biologicamente relevantes e materiais macios.
Introduction
Microscopia de força atómica (AFM), tornou-se uma ferramenta importante para investigar as propriedades estruturais e mecânicas, de superfícies de filmes finos, e as moléculas individuais desde sua invenção em 1986 (Figura 1). 1-3 Usando uma célula de líquido, o método possui tornam-se particularmente útil em estudos de macromoléculas biológicas e células, mesmo vivendo em um ambiente fisiologicamente relevante. 4-10 Tocar de modo AFM tem sido tradicionalmente usada para imprimir materiais macios ou moléculas frouxamente ligados à superfície, pois o contato de modo AFM é tipicamente inadequada devido para os danos causados pelas forças laterais exercidas sobre a amostra pelo cantilever 11. de modo Tapping AFM reduz substancialmente estas forças por ter a ponta intermitentemente toque na superfície, em vez de estar em contacto constante. Neste modo, o braço de suporte é oscilado na ou perto da sua frequência de ressonância normal à superfície. Da mesma forma para entrar em contato de modo AFM, a topografia é analyzed locando o movimento do piezo-z, como uma função de xy (distância).
A dinâmica cantilever pode ser bastante instável em ou próximo da ressonância; portanto, eles são muito difíceis de automatizar fora de uma situação de "estado estacionário". Especificamente, estas dinâmicas dependem as propriedades da amostra e ambiente de digitalização. Para uma molécula macio adsorvido a um (er) superfície dura, um ciclo de feedback bem afinado para a molécula pode levar a oscilação feedback para a superfície. Operação no líquido complica ainda mais a sintonia do cantilever. Alterações nos níveis de temperatura ou de fluidos exigem reajuste constante de ponto de ajuste, ganhos, e outros parâmetros de imagem. Esses ajustes tendem a ser muito demorado e desafiador para os usuários.
Pico de força quantitativa nanomecânicos mapeamento da propriedade (PF-QNM), como tocar modo AFM, evita interações laterais por forma intermitente contactar a amostra (Figura 2). 12-15 </ Sup> No entanto, PF-QNM opera em modo não-ressonante e freqüências muito mais baixas do que pressionar de modo AFM. Isto elimina os desafios de ajuste de modo tapping-AFM, particularmente aqueles exacerbado pela presença de fluido. Com PF-QNM, as imagens são coletadas, tendo uma curva de resposta de força em todos os pontos de contato. Com a adição do software ScanAsyst, 15 de ajuste dos parâmetros de digitalização pode ser automatizado e uma imagem de alta resolução obtidas em questão de minutos, mesmo por usuários inexperientes. Uma vez que o utilizador se torna mais familiarizados com a AFM, qualquer ou todos os parâmetros automatizadas podem ser desactivado em qualquer altura que permita o experimentalista para aperfeiçoar a qualidade de imagem manualmente. Desde a sua criação, PF-QNM foi aplicada para mapear bacteriorhodopsin, uma proteína de membrana e outras proteínas nativas no nível submolecular 16-18 Para bacteriorhodopsin., Há uma correlação direta entre a flexibilidade da proteína e de raios-X estruturas cristalográficas. 12 PF -qnM tem sido utilizada para investigar as células vivas com alta resolução. 19,20 importantes ligações Além disso, os dados de FP-QNM elucidou entre estrutura e mecânica dentro da membrana dos eritrócitos que são essenciais para a integridade e a função da célula 21.
Nós empregamos microscopia de varredura por sonda (SPM) métodos, incluindo 22 AFM, 23 para estudar a estrutura de fotorreceptores de luz vermelha chamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Eles consistem de um módulo de detecção de luz covalentemente ligados a um módulo de sinalização efetuador tais como histidina quinase (HK) 26. O módulo de luz de detecção normalmente contém um cromóforo bilin que passa por uma transformação estrutural mediante a absorção de um fóton, com uma série de mudanças estruturais que atingem o módulo de sinalização efetuador e levando a uma transformação global de toda a proteína . 24,27-29 Com base nesta transformação, existem duas cadeias leves distintas de absorção sstados de BphPs, uma luz absorvendo estado vermelho e vermelho-extremo, denominado Pr e Pfr. Pr é termicamente estável, o estado de adaptação ao escuro para a maioria dos BphPs. 28 A base molecular da Pr / Pfr fotoconversão não é totalmente compreendido, devido ao conhecimento limitado estrutural dessas proteínas. Com a exceção de uma estrutura de D. radiodurans, 30 todas as estruturas cristalográficas de raio-X publicados destas proteínas são no estado de adaptação ao escuro e carecem de domínio efector. Os BphPs intactos são demasiado grandes para serem eficazmente estudada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), e são difíceis de cristalizar na sua forma intacta (em particular no estado de luz adaptado) para a cristalografia de raios-X. BphPs foram recentemente projetado como marcadores de proteínas fluorescentes infravermelho (IFP). 31 Caracterização estrutural dessas proteínas pode ajudar ainda mais no design IFP eficaz. 32-36
O foco deste artigo é apresentar um procedimento paraimagiologia de BphPs utilizando AFM-célula através do líquido PF-QNM. O método é demonstrado pelos estudos de estado de luz adaptado do RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir da bactéria fotossintética R. palustris. O procedimento aqui apresentado é AFM abordagem conveniente e simples para a imagiologia de proteínas, bem como de outras macromoléculas biológicas. Com este método, os detalhes estruturais de moléculas individuais podem ser recolhidas num curto período de tempo, semelhante a um curso de ciência sessão de laboratório de nível superior. Através de medição secções transversais e completando mais análises dimensionais, os dados experimentais pode ser comparado a modelos computacionais úteis 37-42.
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM é um método de microscopia de sonda de varrimento totalmente capazes de fornecer imagens de proteínas e outras macromoléculas biológicas em condições fisiologicamente relevantes. Em comparação com a cristalografia de raios-X e RMN, uma limitação da AFM é a sua incapacidade para alcançar a mesma resolução, particularmente resolução lateral. Quando utilizando AFM para analisar uma molécula em qualquer superfície, o impacto da superfície e da sonda na imagem da molécula também tem de ser considera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O programa NSF-MRI (CHE: 1229103) é reconhecido para o financiamento da compra de novos produtos eletrônicos de controle, software, células líquidos e outros equipamentos necessários para montar uma dupla AFM / STM. Reconhecemos as instalações compartilhadas no The University of Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obter assistência com a AFM instrumentação, treinamento e criação de imagens e de tempo de instrumentos disponibilizados pela Pesquisa de Materiais de Equipamentos (DMR-0820054). Agradecemos especialmente Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, e Prof Ka Yee Lee para acolher os nossos alunos antes do financiamento da proposta NSF-MRI, que trouxe a instrumentação necessária para o nosso campus. Reconhecemos o financiamento de uma bolsa Título III STEM (ID: P031C110157) atribuído à Northeastern Illinois University, que ofereceu remuneração de pesquisa de verão para alunos e professores, bem como suporte para produtos de consumo. Finalmente, reconhecemos Bruker-Nano, Inc. para suporte instrumental continuou e permissão para reproduce um gráfico que mostra o mecanismo de PeakForce QNM e para utilizar a palavra ScanAsyst para descrever o software automatizado.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
Referências
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
