Ein<em> Ex vivo</em> Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Verletzte CNS Axone nicht zu regenerieren und oft zurückziehen von der Verletzungsstelle. Axone aus der anfänglichen Verletzung verschont später sekundärmetallurgisch axonale Degeneration. Mangel an Wachstumskegel Bildung, Regeneration, und der Verlust von weiteren markhaltigen Axonen Projektionen im Rückenmark stark einschränkt neurologische Erholung nach einer Verletzung. Um zu beurteilen, wie zentral myelinisierten Axone im Rückenmark, um Verletzungen zu reagieren, haben wir eine ex vivo lebenden Rückenmark-Modell unter Verwendung von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Axonen und eine Brenn und hoch reproduzierbare Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen zum Ausdruck bringen, um das Schicksal zu dokumentieren Axone und Myelin (lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nile Red) im Laufe der Zeit mit Zweiphotonenanregung Zeitraffer-Mikroskopie. Dynamische Prozesse wie akute axonale Verletzung, axonale Retraktion und Myelin-Degeneration sind am besten in Echtzeit untersucht. Doch die Nichtschwerpunkt Natur Prellung basierte Verletzungen und Bewegungsartefakte auftretenwährend der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Mikroskopie Herausforderung. Der Ex-vivo-Rückenmark-Modell hier beschriebenen imitiert verschiedene Aspekte der klinisch relevanten Prellung / Kompression induzierte axonalen Pathologie einschließlich axonalen Schwellungen, Sphäroidbildung, axonalen Durchtrennung und peri-axonalen Schwellungen ein nützliches Modell, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu studieren. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind ausgezeichnet räumlich-zeitliche Auflösung, die Differenzierung zwischen Primär- Beleidigung, die direkt verletzt Axonen und sekundären Verletzungsmechanismen ermöglicht; kontrollierte Infusion von Reagenzien direkt auf den Perfusat Bade das Kabel; präzise Änderungen der Umgebungsmilieu (zB Calcium, Natriumionen, bekannt Beitrag axonale Verletzung, aber praktisch unmöglich, in vivo zu manipulieren); und Maus-Modelle bieten auch einen Vorteil, da sie die Möglichkeit bieten, zu visualisieren und zumanipulieren genetisch identifizierten Zellpopulationen und subzellulärer Strukturen. Hier beschreiben wir, wie die Isolierung und das lebendige Bild Rückenmark von Mäusen, um die Dynamik der akuten axonalen Verletzungen zu erfassen.

Introduction

Degeneration von Axonen ist eine prominente Ursache für Morbidität über mehrere neurologischen Erkrankungen einschließlich Neurotrauma, Schlaganfall, Autoimmunerkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen. Im Gegensatz zu dem peripheren Nervensystem (PNS), Zentralnervensystem (ZNS) Axone haben eine begrenzte Kapazität zu regenerieren, sobald aufgrund sowohl intrinsische als auch extrinsische Barrieren (dh inhibitorische Moleküle axonale Wachstum während der Narbenbildung während der Myelindegeneration produziert und freigesetzt) ^​​1 verletzt ^-7. Obwohl einige dieser Hindernisse wurden intensiv erforscht, therapeutische Interventionen Ziel, ZNS-axonale Degeneration verhindern, fördern robuste axonale Regeneration und Wiederherstellung funktions verbindend, begrenzt bleiben.

Axone einmal von ihren Soma getrennt durchlaufen eine stereotype Prozess der Degeneration wie Waller-Degeneration, die durch axonalen Schwellungen, Sphäroid Bildung und eventuelle Fragmentierung (in ^{8 mit Beiträgen)} gekennzeichnet ist bekannt. InDagegen ist der proximale Stumpf, der in Kontinuität mit dem Soma eines durchtrennten peripheren Axonen bleibt, bildet eine Schwellung an seinem Ende, Matrizen zurück zur nächsten Knoten Ranvier, und kann dann zu initiieren Wachstumskegel Aufstellung für nachfolgende axonale Regeneration eine wichtige Voraussetzung erforderlichen ^9-11. Im Gegensatz dazu sind die proximalen Enden von axonalen vielen zentralen Axone bilden charakteristische "endbulbs" oder Einfahren Glühbirnen, nicht zu Wachstumskegeln bilden, und statt zurückzuziehen von der Verletzungsstelle, wo sie für die Monate nach der Verletzung ^12-15 bleiben. Neben der primären axonalen Schädigung, können zusätzliche axonalen Schäden / Verluste auch Axone, die im Wesentlichen aus der anfänglichen Verletzung verschont auftreten. Diese verzögerte axonalen Verlust zunächst verschont Axone wird als Sekundär axonale Degeneration bezeichnet. Diese inhärente Reaktion von ZNS Axone Schädigung macht funktionale axonale Regeneration noch schwieriger Ziel im Gehirn und Rückenmark zu erreichen.

Obwohl hallmarks der axonalen Schädigung (zB Sphäroidbildung, Rückzug Glühbirnen) wurden auch von post-mortem Gewebe und experimentellen Modellen der axonale Degeneration gekennzeichnet hat Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser dynamischen Prozesse sind beschränkt. Die meisten dieser Studien angeführten statischen Endpunkt Beobachtungen, die von Natur gescheitert einzelne axonalen Antworten über die Zeit zu erfassen. Obwohl exogen applizierten axonalen Tracern nützlich gewesen zu axonalen Antworten von statischen Abschnitten und während der Live-Bildgebung zu klären, hat die Verfügbarkeit von genetisch kodierten axonalen Marker stark verbessert unsere Fähigkeit, Axone in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. In der Tat, eine wegweisende Bericht Kerschensteiner und Kollegen zunächst vorgesehen unmittelbarer Nachweis der axonalen Degeneration und Regeneration in vivo mit Thy1 -GFP-S Mäuse, die das grün fluoreszierende Protein in Teilmengen von Neuronen, die ihre Projektionen in die Hinterstränge des Rücken senden kodierenKabel ^16. Live-Imaging-Ansätze mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) und genetische fluoreszierende Protein Markierung von Zellen von Interesse nach wie vor direkte Beweise und mechanistischen Einblick in viele verschiedene dynamische Prozesse wie axonale Degeneration, Ca ²⁺ Signal, axonale Regeneration, Astrozyten Physiologie liefern, Mikroglia Physiologie und Reaktion auf eine Verletzung ^17-25.

Im Gegensatz zu den Axonen ist sehr wenig von Myelin Reaktionen auf Verletzungen in Echtzeit bekannt. Myelin ist ein wesentlicher Bestandteil der weißen Substanz produziert und von Oligodendrozyten im ZNS und Schwann-Zellen in der PNS erhalten. Myelin isoliert 99% der Oberfläche von Axonen und dadurch eine hochohmige, kapazitätsarme Schutzabdeckung, die eine schnelle und effiziente saltatory Impulsausbreitung, die kürzlich von Buttermore et al. ²⁶ überprüft unterstützt. Um die Dynamik von Myelin, um Verletzungen verwenden wir die solvatochromen, lipophile erfassenFluoreszenzfarbstoff Nile Red ^27. Solvatochromen Eigenschaften dieses Vitalfärbung erlauben Spektralverschiebungen seines Emissionsspektrums, das von der physikalisch-chemischen Umgebung ^28,29 ist. Diese Eigenschaften sind nützlich, um Einblick in die Mechanismen der axomyelinic Verletzungen zu gewinnen und können mit entsprechend ausgewählten dichroitische und Emissionsfilter sichtbar gemacht oder gelöst mit spektralen Mikroskopie ²⁷ werden. Zum Beispiel ist Nilrot Emissionsspektrum blau-verschoben in weniger polare lipidreichen Umgebungen, wie sie in Adipozyten und normale CNS Myelin (Spitzenemission ~ 580-590 nm) ²⁷ gefunden. Im Gegensatz dazu Emissionsspektrum Spitzen dieser Vitalfarbstoff ist bei ~ 625 nm in endbulbs wie Axone gebildet ziehen axonalen Sterben ^27. Obwohl die genauen Mechanismen dieser spektralen Verschiebungen speziell in endbulbs gegenüber normalen Myelin unklar bleiben, können solche spektralen Veränderungen zugrunde liegenden Veränderungen der Proteinakkumulation oder Desorganisation, die zu enthüllenExposition von hydrophoben Bindungsstellen ^27.

Während in-vivo-Bildgebung ist die entscheidende Messgröße für die Beobachtung des Rückenmarks axonalen Verletzungen Dynamik in ihrer natürlichen Umgebung, es ist technisch anspruchsvoll und erfordert erhebliche chirurgischem Know-how und oft wiederholen Operationen, um die dorsalen Säule, die experimentellen Artefakten führen kann ausgesetzt werden (zB Entzündungen und Narben Bildung). Außerdem ist teure Ausrüstung oft notwendig, um Suspendierung und Positionierung von einem intakten Tier unter der Mikroskopobjektivlinse ermöglicht. Die Tiere müssen sorgfältig überwacht werden, als auch, um sicherzustellen, bleiben sie warm, um sicherzustellen, Flüssigkeiten wieder aufgefüllt werden, und um sicherzustellen, gibt es keine Anzeichen von Hypoxie aufgrund längerer betäubt Imaging-Sitzungen. Letzteres ist äußerst wichtig, da Axone und Myelin unbedingt benötigen konstante Durchblutung und eine angemessene Sauerstoffgehalt lebensfähig zu bleiben. Dies ist jedoch oft nicht gemeldet oder in den meisten in-vivo-Studien zu überwachenDatum. Zusätzlich Bewegungsartefakte durch Herzfrequenz und Atmung (Isofluran erwachsenen Maus: ~ 300-450 Schläge pro Minute (BPM) ist optimal, um 97 bis 98% Sauerstoffsättigung (wie normal ~ 632 BPM) und pflegen ~ 55-65 Atemzüge pro min (normal ist ~ 163 Atemzüge pro min), beziehungsweise)) ³⁰ während der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make begegnet differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie Herausforderung als auch die schnellsten Laserscans unvermeidlich unterliegen diese Bewegung Artefakte. Fortschritte in der ultraschnellen Resonanzscanner in Verbindung mit einem implantierbaren starren Wirbel gerahmte Fenster können Abbildung der Maus Rückenmark bei wachen Tieren zu ermöglichen, aber schnellere Scanzeiten zwangsläufig das Signal-Rausch-Verhältnis Bild erniedrigender Qualität. Weitere Verbesserungen in der Rückenmarksbildgebenden Verfahren, wie sie derzeit für die Bildgebung des Gehirns verwendet werden, können viele dieser Hindernisse zu überwinden und potenziellen verwechselt von ina eingeführt begrenzendequate Gewebedurchblutung, zB ^31-33.

Vieles, was über der weißen Substanz Physiologie und Mechanismen der weißen Substanz Verletzungen bekannt wurde nach den in vitro oder ex vivo Zubereitungen der weißen Substanz von Sehnerv, der peripheren Nerven und Bänder des Rückenmarks weißen Substanz ^{34 bis 41} bestimmt. Diese Präparate weiterhin unser Wissen über weißen Substanz Verletzungsmechanismen zu fördern, da sie ermöglichen eine kontrollierte Veränderungen der Umweltfaktoren, kontrollierte Anwendung von Arzneimitteln und Reagenzien, Funktionsprüfungen mit der Elektrophysiologie und die direkte Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen der Axone und Myelin in lebendem Gewebe. Doch einige frühere Ansätze zur Axone Rückenmark dorsalen Säule Streifen oder ventralen weißen Substanz Streifen beobachten unweigerlich verletzen Oberfläche Axone während der Entfernungsstufe, die die Reaktion von eng gegen Axone beeinflussen können. Um auf die experimentelle Manipulationen oben zu nutzen und vermeiden Schäden an der very Fasern untersucht, verwenden wir eine ex vivo Halsmark-Modell, da es einen direkten Kontakt der Dorsalseite des Kabels verhindert. Somit ist die Architektur der Pia und neben oberflächlichen dorsalen Säule Axone tragfähige und gelassen bleiben, während der Isolierung.

Hier beschreiben wir eine relativ einfache Methode, die direkte Visualisierung von zentraler markhaltigen Axonen, da sie dynamisch mit einer Brenn Verletzungen in Echtzeit bis zu 8 reagieren können – 10+ Stunden nach der Verletzung. Die laserinduzierte Verletzung des Rückenmarks (Liščí) Modell erlaubt die Unterscheidung zwischen primären und sekundären axonalen Verletzungsmechanismen als primäre Läsion (Ablationsstelle) bleibt räumlich über die Zeit eingeschränkt. Die Open-Bad Abbildungskammer ist zugänglich für eine therapeutische Intervention, Reagenz Lieferung und Umwelt Manipulationen. Vermeintliche axomyelinic Schutzmittel lassen sich schnell in Echtzeit durch direkte Beobachtungen gegenüber langwierigen und kostenintensiven Experimenten mit Gewebeprozess bewertet werdening, Schneiden, Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse und daher eine nützliche Ersatzmodell zu akuten Reaktionen und Schutz Manipulationen vor der Prüfung die experimentellen Agenten mit lebenden Tieren zu bewerten.

Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden unter Leitlinien von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Louisville gesetzt durchgeführt, um Bundesvorschriften einzuhalten. 1. Vorbereitung der Low Ca 2+ und 2 mM Ca 2+ Künstliche Liquor (aCSF) Perfusaten Bereiten 2x niedrigen Ca 2+ (0,1 mM) Auf C-Puffer, 2x Normal Ca 2+ (2 mM) Auf A-Puffer und 2x Auf B-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben….

Representative Results

Einzelheiten einer geeigneten Labor einrichten musste isolieren, halten die Lebensfähigkeit und die Bild ex vivo Rückenmark ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Mikroskop muss mit einem abstimmbaren gepulsten Femtosekundenlaser, entsprechende dicroics und Emissionsfiltern und einem wasser ausgestattet werden Eintauchen Objektivlinse mit einer hohen numerischen Apertur (≥1.0). Die Lebensfähigkeit des Rückenmarks während der Präparation zu gewährleisten, sollte das Verfahren in Gegenwart …

Discussion

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Bildgebung des Rückenmarks myelinisierten Axone (dh Fasciculus gracilis), kombiniert mit einem Laser-induzierte Verletzung des Rückenmarks, die dynamische Fortschreiten der primären und sekundären myelinisierten axonale Degeneration im Laufe der Zeit zu studieren. Ex-vivo-Bildgebung der Oberfläche das Rückenmark überwindet viele der Komplikationen, die mit in-vivo-Abbildung zugeordnet, wie Bewegungsartefakte und das Potential der Experi…

Materials

Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin