A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos. Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.
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Artigo de método
Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs) são consideradas o padrão-ouro para aplicações de engenharia de tecidos baseadas em células-tronco. No entanto, o processo pelo qual eles devem ser colhidos pode estar associado a uma morbidade significativa da área doadora. Em contraste, as células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs) são mais facilmente abundantes e mais facilmente colhidas, tornando-as uma alternativa atraente às BM-MSCs. Como as BM-MSCs, as ASCs podem se diferenciar em células de linhagem osteogênica e podem ser usadas em aplicações de engenharia de tecidos, como semeadura em andaimes para uso em defeitos esqueléticos craniofaciais. As ASCs são obtidas a partir da fração vascular estromal (SVF) do tecido adiposo digerido, que é uma mistura heterogênea de ASCs, células endoteliais e murais vasculares, células musculares lisas, pericitos, fibroblastos e células circulantes. A análise por citometria de fluxo mostrou que o perfil do marcador de superfície para ASCs é semelhante ao das BM-MSCs. Apesar de vários relatos publicados estabelecerem marcadores para o fenótipo ASC, ainda há falta de consenso sobre os perfis que identificam células osteoprogenitoras nessa população heterogênea. Este protocolo descreve como isolar e usar uma subpopulação de ASCs com capacidade osteogênica aprimorada para reparar defeitos de calvária de tamanho crítico.
Introdução
A natureza heterogênea das populações de células-tronco ainda não é totalmente compreendida e continua sendo um grande impedimento para o desenvolvimento de aplicações terapêuticas baseadas em células-tronco clinicamente eficazes. Uma das maneiras mais comuns de caracterizar uma população heterogênea de células-tronco é empregar um método de classificação celular, como a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), para separar as células com base em seus perfis de expressão de marcadores de superfície. À medida que os métodos de classificação se tornam mais complexos, torna-se possível identificar subpopulações funcionais de células mais distintas. As tecn....
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Protocolo
NOTA: Todas as amostras dos pacientes foram obtidos com o consentimento informado, e os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Stanford University Institutional Review Board (Protocolo nº 2188 e # 9999).
1. Isolamento celular e Cultura:
- Obter tecido adiposo subcutâneo humano de pacientes saudáveis do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletiva do abdômen, flanco, e / ou região de coxa sob anestesia local / geral. Certifique-se de que Institutional Review Board (IRB) a aprovação foi obtida para o protocolo de isolar ASC de tecidos humanos, e siga as precauções de segurança institucionais ao trabalhar com....
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Resultados
Usando CD90 como um marcador para células com melhores resultados de osteogénese no isolamento de uma população altamente enriquecidas de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC foram coradas com azul-Pacífico CD45 conjugado anti-humano, conjugado com FITC anti-CD105 humano, e CD90 anti-humano conjugado com APC. Após a separação, o nível de pureza foi superior a 98%, tal como quantificado por análise post-tipo.
Definição de grupos de células com base em perfis de transcrição permit.......
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Discussão
Actualmente, o isolamento de subpopulações homogéneas de ASC de SVF de tecido adiposo humano continua a ser um desafio embora objectivo desejável. Isolamento de subpopulações ASC pró-osteogénicas é particularmente desejável, uma vez que tais células podem ser utilizadas para estudar a formação e a homeostase do tecido esquelético. No entanto, o SVF de tecido adiposo abriga heterogeneidade significativa no que diz respeito a conter capacidade celular e potencial de diferenciação. 11 A base molecular para esta .......
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Divulgações
Nenhum dos autores têm um interesse financeiro em qualquer um dos produtos, dispositivos ou drogas mencionadas neste artigo. Nenhum dos autores tem qualquer interesse financeiro competindo para relatar.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health Research concessão R01-DE021683-01 e National Institutes of Health Research concessão R01-DE019434 para MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship para MTCDCW foi apoiado pela ACS Franklin Martin Faculdade Research Fellowship, O Laboratório Hagey for Pediatric Regenerative Medicine, e do Instituto de Pesquisa de Saúde Infantil da Universidade de Stanford Faculdade Scholar Award.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos Cônicos Descartáveis de 250 ml | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX Gibco | 10566-016 | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Solução Antisséptica Povidona/Iodo | Purdue; | PFC-67618015017 | |
| Solução de Sal Balanceada Hank's, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Soro Fetal Bovino, Certificado, Origem dos EUA | Gibco | 16000-044 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Solução de Desprendimento de Células | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (substituição do Azul Pacífico) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Estreptavidina PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrumento | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
Referências
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298
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Reimpressões e permissões
