A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).
Myocardinfarct blijft de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse landen, ondanks de aanzienlijke vooruitgang in de stent gebiedsontwikkeling in de laatste decennia. Ter verduidelijking van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën, de beschikbaarheid van geldige diermodellen zijn verplicht. Omdat we nieuwe inzichten in pathomechanismen van hart- en vaatziekten moeten onder in vivo omstandigheden hartinfarct te bestrijden, de geldigheid van het diermodel is een cruciaal aspect. Echter, de bescherming van de dieren zijn zeer relevant in deze context. Daarom stellen we een minimaal invasieve en eenvoudig model van myocardiaal infarct bij muizen die een hoge reproduceerbaarheid en de overlevingskans van de dieren zorgt. Zo, dit model voldoet aan de eisen van het 3R-principe (vervanging, verfijning en vermindering) voor dierproeven en zorgen voor de wetenschappelijke informatie die nodig is voor de verdere ontwikkeling van therapeutische strategieën voor cardiovascular ziekten.
Myocardiaal infarct is een van de belangrijkste doodsoorzaken in de geïndustrialiseerde landen. Ondanks onmiskenbare vooruitgang van diagnostische en therapeutische benaderingen, hart- en vaatziekten zijn nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak. Gezien de verbeterde levensverwachting en levensreddende risico's, is een voortdurende toename van de incidentie van hart- en vaatziekten in de toekomst verwacht. Daarom is er een sterke behoefte aan nieuwe benaderingen vaststellen en valideren voor de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen. De informatie in humane studies lijdt zijn beperkingen, deze studies doorgaans onvoldoende te leggen en begrijpen van de mechanismen op moleculair niveau, niet in staat om oplossingen voor deze belangrijke gezondheidsproblemen verschaffen.
Bovendien is fundamenteel onderzoek beperkt gevolge van de complexiteit en moeilijkheid om de mechanismen van hart- en vaatziekten reproduceren in het laboratorium. Daarom, om onze kennis over de pathofysiologie van cardiovaatziekten, is het essentieel om diermodellen 1,2 valideren. Echter, alle stromen van moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij de genezing na myocardiaal infarct, analyse op verschillende tijdstippen nodig identificeren, waardoor een groot aantal dieren proeven.
Myocardinfarct experimenten worden vaak uitgevoerd met behulp van diermodellen. Het induceren van myocardiaal infarct bij gezelschapsdieren 3-11 is de meest geschikte en efficiënte model toegepast om cellulaire en moleculaire gebeurtenissen dan grote diermodellen onderzoeken. Bovendien was geen ander soort, de beschikbaarheid van transgene of knockout stammen muizen 12. Deze muizen zijn zeer nuttig in andere ziekten, zoals cardiovasculaire ziekten (zoals atherosclerose, in stent restenose) 13,14. Bovendien, de lage zwangerschapsperiode en het grote aantal nakomelingen kwalificeren muismodellen zoals aantrekkelijkste systeem moleculaire mechanismen voor myocardiale Infa bestuderenrction 12.
Toch is de grootte van het hart bij muizen verwacht hoge precisie manipulatie tijdens microchirurgie. Lesgeven dergelijke gekwalificeerde en deskundige operatie personeel is een tijdrovend en arbeidsintensief proces. Daarom hebben we hierin een gedetailleerd microchirurgie procedure, inclusief tips en trucs om medewerkers zelfs met gemiddeld kwalificaties, zoals studenten of technici om de complexe hartinfarct model in muizen te voeren begeleiden.
Aanvankelijk wordt intubatie uitgevoerd door middel van een korte canule zonder de tracheotomie. De thoracale incisie ligt in de intercostale ruimte vermijden verwonding ribben en / of het omringende weefsel. Deze sub-stap is zeer relevant voor snel herstel en genezing 15 te verzekeren. De ligatuur wordt gemaakt differentiële chronische ischemie en ischemie / reperfusie model, voor een hoog overlevingspercentage behoud van een aanzienlijke mate van een infarct. Onze ervaring leert that behulp zijden hechtdraad zorgt voor een hogere reproduceerbaarheid in vergelijking met cryo-letsel 16.
Concluderend, de hier beschreven werkwijze is zowel chronische ischemie en ischemie / reperfusie model in kleine proefdieren toepassing. De tips en trucs die in deze procedure zijn bedoeld om personeel met zelfs lage of gemiddelde kwalificatie in staat stellen om te passen in kleine diermodellen.
Tijdens de procedure zijn er enkele kritische punten gewezen: de intubatie, het openen van de borstholte en de LAD ligatuur. De eerste kritische stap is de intubatie van het dier voordat experiements. Veel groepen gebruiken een verticale steun voor het bevestigen van de muis en een lichtbron direct aan de canule in de luchtpijp plaatst. Deze methode heeft onzekerheid over de juiste plaatsing van de canule in de luchtpijp en de meest gevoelig voor storing door beginners. Een kleine incisie kan de positie van de canule worden gecontroleerd gedurende de gehele figuur, waardoor de standaard afnemend. Bovendien wordt de tracheotomie overschreden, waardoor complicaties verminderen en het verminderen van de werkingstijd.
De volgende belangrijke stap is het openen van de borstholte. De mediane sternotomie staat voor een hoog risico manoeuvre vertragen het herstel van de dieren. De laterale linker incisie impliceert het snijden van 2-3 ribben 15 </sup>, leidt tot gebrekkige herstel en verhoogde sterfte. We gebruikten in het model kleine, discrete incisie tussen de ribben met minimale belasting. De dieren herstellen zeer snel na de operatie en niet de schade punten of verstoord genezing. De onderste inter-costal space wordt als referentiepunt. Gezien dit, de correcte en gedifferentieerde toegang tot de ligatuur plaats voor chronische en ischemie / reperfusie model, geen ernstige problemen te verhogen.
De ligatuur zelf vertegenwoordigt de meest kritische stap. De linker dalende kransslagader moeilijk zichtbaar worden gemaakt, en moet vaak zonder te zijn gebonden. Daarom worden bepaalde anatomische referentiepunten wees de chirurg de juiste ligatie te voeren. Voor de chronische infarct model wordt de ligatuur geplaatst in het midden van de ventrale zijde van het hart tussen de oorschelp en de apex, boven het einde van de grote ader anterior (figuur 2B). De efficiëntie kan worden controgevuld door het visualiseren van de verschijning van de grijze kleur in de getroffen gebieden. Als het infarctgebied weergegeven anterior en niet de achterwand omvatten een nieuwe hechtdraad geplaatst links van de eerste hechting. De belangrijkste oorzaak van LAD is altijd zichtbaar onder de oorschelp 18, en dus geen ernstige problemen opleveren bij het opsporen van dit deel. De oorschelp geeft grote kans op bloeden en moet zorgvuldig worden omgegaan.
De procedure wordt beperkt door het bestaan van geschikte apparatuur. Een ventilator en geschikte anesthesie voor kleine dieren zijn duur en vereisen aansluitingen gas en ventilatiesysteem van de kamer. Verder wordt een nauwkeurige controle van de dieren moet eerst week na behandeling om de mogelijke klinische detecteren. Om de hartfunctie tijdens het experiment te onderzoeken, zijn hoge-resolutie echografie, complexe Langendorf perfusie-systeem, of kleine intraventriculaire catheter metingen nodig, invOlving hoge kosten en aanvullende expertise.
Gezien de myocardiaal infarct, is er geen alternatieve methoden beschikbaar om de complexiteit van de gebeurtenissen in vitro reproduceren. Afhankelijk van de bezienswaardigheid, ex vivo perfusie van een geïsoleerde hart in Langendorff systeem geeft informatie over de contractiliteit, hartfunctie en myocard levensvatbaarheid in reactie op verschillende stimuli of drugs. Echter, exclusief eventuele storingen van bloedcomponenten en het immuunsysteem, en is niet geschikt voor lange-studies van remodellering en genezing na myocardiaal infarct.
Na het uitvoeren van het hartinfarct procedure kunnen andere functionele analyse uitgevoerd zoals intraventriculaire drukmetingen, ultrasound (klein dier ultrasoundsystemen) of geïsoleerde hart Langendorff perfusie. Bovendien kunnen alle biologische en moleculaire analyse uitgevoerd worden om cellen, eiwitten, mRNAs, microRNA identificeren genes of andere biomarkers, die kunnen worden toegepast als therapeutische doelwitten om nieuwe behandelingsstrategieën voor myocardiaal infarct ontwikkelen.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | |
Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 730043 | Model Minient 845 |
Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Harvard Apparatus | Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8" x 11" footprint. | |
Intubation cannula | Harvard Apparatus | 732737 | |
Forceps | FST, Germany | 9119700 | standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm |
Scissors | FST, Germany | 9146011 | straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | |
Retractors | FST, Germany | 1820010 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 1820011 | 5mm wide |
Wire handles | FST, Germany | 1820005 | 10cm |
Wire handles | FST, Germany | 1820006 | 14cm |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | ||
Xylazine 2% | Medistar, Germany | ||
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custommade product | diameter 500µm |
section thickness 100 µm | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | |
Ultrasound | Vevo, Canada | 770 Vevo |