We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
单个分子上活细胞的动力学有利于它们的生物学功能。单分子荧光成像技术是研究细胞表面上的1,2,3单分子动力学的常用方法。然而,在这些研究中最常用的成像探头具有几个重要的缺点。例如,传统的有机染料和荧光蛋白质提供中等亮度,大约10 5 -10 6 M -1 -1,但是光化学不稳定的,大约10 5 -10 6的光子典型的活细胞成像的条件下的发光后,漂4,5。与此相反,半导体纳米颗粒,常称为量子点(QDs),是显著更明亮,更稳定,具有消光系数为10 6 -10 7 M -1 -1的范围和超过photobl前10 7 -10 8发射的光子eaching 5。量子点在有机荧光团的改进的亮度和光使单个分子的显著更快的帧速率的观察和对更长的轨迹6。
尽管他们的优势和商业可用性,连带责任仍是这些强大的显像剂。第一,他们定义不清靶向价,这可能导致在目标生物分子6的交联。第二,它们通常具有较大的流体动力学大小(> 20纳米),限制访问某些拥挤的蜂窝环境7。第三,它们具有有限的定位模块7。几种策略试图解决这些问题8,9,10,但一般需要专门的知识和试剂来实现。
为了解决这些问题,我们最近报道了“空间排阻”战略制备单价,小,模块化的量子点11。该量子点包裹着一个长硫代磷酸酯的DNA(ptDNA)聚合物。该ptDNA结合通过表面暴露的锌原子和ptDNA聚合物的磷酸酯基团之间的多个锌-S相互作用的量子点表面。一个单一的结合聚合物的空间位和静电不包括聚合物的额外当量的结合而不显著增加粒子的总尺寸(约2nm)。所有试剂均为市售产品,形成以高收率,并且该过程仅需要脱盐工序进行精制。一旦标记,量子点包裹着一个ptDNA(MQDS)结合轴承的目标领域( 如 ,苄基鸟嘌呤(BG),苄基胞嘧啶,或烷基卤化物)互补DNA链。
这些功能针对MQDS具体酶标记,如SNAP,CLIP&HALO被基因融合到感兴趣的蛋白质。这是一个协议,用于合成,目标,并通过空间排阻生产MQDS的活细胞成像。
在MQD设计的模块化使得实验的灵活性程度增加。例如,各种MQDS可以快速的在独特的颜色,允许多个目标的同时成像制备。单链DNA靶序列可以直接MQDS蛋白质,糖类12,脂类和表面13。是许多酶标记可用正交反应性,允许多个目标,同时以差异有针对性的MQDS成像。除了使用SNAP标签定位,靶蛋白与使用CLIP标签,哈洛标签,MQDS和生物素蛋白标记也是成功的。此协议表明活细胞上与这些MQDS表面受体的特异性标记,但该协议可以很容易地适应于许多不同的场合。
生产MQDS与定义的化合价的显著方法论的观点是〜50硫代联碱是必需的,以包住量子点(并因此防止两个分子从同时绑定)。多聚A S 50序列可重复和稳定结合自Life Technologies 605纳米的量子点。虽然这款产品已经停产,空间排阻策略推广到由具有不同尺寸,形状,光谱特性等厂商的同类产品。
ptDNA包裹量子点的效率和稳定性主要取决于量子点的表面化学性质和结构。因此,协议的成功将取决于量子点的商业来源和化学结构。对于这个协议的目的,量子点的各种商业渠道之间存在差异的三大要点:在必要的相转移条件的差异;在最初的PEG-硫醇配体结合,这可能阻碍位移由ptDNA的强度差;以及在暴露的CdSe核心的量的差异,从而可以勒广告到QD的由MPEG硫醇相转移条件下淬火。
至于出版,量子点与生产MQDS的最佳结构是4-10自Life Technologies在545,585,605和625纳米( 图2A)购买了发射光谱波长的CdSe / ZnS核/壳量子点。基于'鲜艳'制剂(545,605 等 ) 的量子点的淬灭后,另外的mPEG硫醇,并且不适合于这种应用。自Aldrich和海洋纳米量子点的工作很好,但需要更长的相转移步骤和预处理与三辛基氧化。该协议进行了优化,从生命技术的量子点。
用来包裹量子点聚硫代磷酸酯序列终止与含(ACTG)5到靶向股可杂交序列的原生20个碱基的DNA尾巴。这个序列是方便的,因为它具有很少或几乎没有二级结构,并且将保持hybridiz版在37℃的PBS中。如果存在进入DNA合成仪中,ptDNA可以使用C 8柱通过合成,然后通过反相高效液相色谱法(HPLC)纯化。该ptDNA将在高效液相色谱比同等的寡核苷酸与本地骨干后来洗脱。我们通常会留下5'DMT保护基团对我们的硫代磷酸酯寡核苷酸纯化后。
通常需要为了提高量子点的胶体稳定性和降低背景的大多数实验应用结合ptDNA包裹的量子点的钝化。该协议采用的PEG层钝化量子点。羧基的PEG链烷硫醇与额外的PEG单元((CO 2 H)CH 2 O(CH 2 CH 2 O)12 C 11 H 23 SH基,羧基-PEG12烷硫醇)提供显著降低背景,虽然更长的PEG都较大,和通常更昂贵。 MQDS涂上羧基聚乙二醇ALKANE硫醇配位体是在生理缓冲液非常稳定,例如磷酸盐缓冲生理盐水,并培养介质。 MQDS在4℃下长期储存(> 8个月)没有表现出显著聚集或ptDNA支队11。根据该实验时,在量子点的PEG钝化本身并不总是充分地降低非特异性的MQDS的结合。在含有3%BSA的基本上在使用前20分钟的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育两细胞和MQDS减少非特异性结合到细胞中,尽管它由〜50%增加的MQDS的表观流体动力学半径。钝化,用0.5%酪蛋白降低了非特异性结合,甚至进一步,但它增加了表观尺寸比BSA更大的程度。
DNA链互补的MQDS的5'末端可以进行修改,以使多个不同的生物分子的靶向。有一批建立的技术可用于共价修饰的蛋白,升ipids与糖的单链DNA(ssDNA)。只要单链DNA在细胞外出现,它就可以到达易溶MQDS。 MQDS与上述序列将迅速与细胞培养条件下与其互补的DNA链杂交。可能需要的ptDNA和靶向序列之间的10-20x聚(CT)间隔为有效的靶向,从而提高了结合序列的厚和带负电荷的多糖包被的细胞之上。对于这个协议,我们选择了以生产BG-DNA与(CAGT)5的互补序列,将二者杂交的MQDS和共价本身链接到SNAP-标签蛋白快速,特异标记。类似的协议功能以及用于连接其它的NHS-酯,以氨基修饰的寡核苷酸。
为单分子成像,通常需要标记的低密度解决单个分子。对〜0.5纳米的PBS最后MQD浓度钝化剂是一个很好的目标。然而,这些高稀释度有时导致下标记的细胞。如果出现这种情况,附加MQD可以添加到标签的最佳密度是观察。在SNAP-标签的人类Notch1基因的情况下,> 10nM的MQD浓度产生致密的标记细胞,同时为0.5nM MQD导致的附着〜20 MQDS在靶向细胞的基底表面(参见图4B)。与MQDS细胞标记高度依赖镀细胞的汇合。过度融合细胞不标注在自己的基础面。
总之,一个简单的方法来生成一价和模块化量子点被描述。这些MQDS找到实用的多种活细胞成像的应用,主要表现在成像活U2OS细胞的Notch受体。 MQDS的适用性并不局限于这个特定的情况下,但也可以潜在地延长了其它细胞靶标,如其它蛋白质,核酸和酶。
The authors have nothing to disclose.
由国防部W81XWH – 1023年10月1日(张家港),从加州大学旧金山分校中心的系统与合成生物学(张家港)批P50 GM081879,美国国立卫生研究院5R21EB015088-02(YJ)和美国国立卫生研究院1R21EB018044(张家港与YJ)提供资金。 DS是由人类前沿科学计划跨学科的博士后研究奖学金支持。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |