We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Dynamikken af enkelte molekyler på levende celler bidrager til deres biologiske funktion. Enkelt molekyle fluorescensimagografi er en populær metode til at studere enkelt molekyle dynamik på celleoverfladen 1,2,3. Men det mest almindeligt anvendte billeddiagnostiske prober i disse undersøgelser har flere vigtige ulemper. For eksempel, konventionelle organiske farvestoffer og fluorescerende proteiner giver moderat lysstyrke, omkring 10 5 -10 6 M-1cm-1, men er fotokemisk ustabile, blegning efter udledningen af omkring 10 5 -10 6 fotoner under typiske live-cell imaging betingelser 4,5. I modsætning hertil halvleder nanopartikler, ofte kaldet kvantepunkter (QDs), er betydeligt lysere og mere stabil, med ekstinktionskoefficienter i størrelsesordenen 10 6 -10 7 M -1 cm -1 og over 10 7 -10 8 udsendte fotoner før photobleaching 5. Den forbedrede lysstyrke og fotostabilitet af QDs end organiske fluoroforer muliggør observation af enkelte molekyler til væsentligt hurtigere frame rates og over meget længere baner 6.
På trods af deres fordele og kommercielle tilgængelighed, forbliver flere forpligtelser for disse magtfulde billeddannende midler. For det første har de dårligt defineret målretning valens, som kan resultere i tværbinding af målrettede biomolekyler 6. For det andet, de generelt har en stor hydrodynamisk størrelse (> 20 nm), der begrænser adgangen til visse overfyldte cellulære miljøer 7. For det tredje har de begrænset målretning modulopbygning 7. Adskillige strategier har forsøgt at løse disse problemer 8,9,10, men generelt kræver specialiseret viden og reagenser til at gennemføre.
For at løse disse problemer, vi for nylig rapporteret om en "Sterisk Udelukkelse" strategien for forberedelsen af monovalente, små, ogmodulære QDs 11. De QDs er omviklet med en enkelt lang phosphorthioat- DNA (ptDNA) polymer. Den ptDNA binder sig til QD overfladen gennem flere Zn-S-interaktioner mellem overfladeeksponerede Zn atomer og de phosphorthioatgrupper af ptDNA polymer. En enkelt bundet polymer sterisk og elektrostatisk udelukker binding af yderligere ækvivalenter af polymeren uden væsentlig forøgelse af partiklens samlede størrelse (ca. 2 nm). Alle reagenser er kommercielt tilgængelige produkter, der dannes i højt udbytte, og processen kræver kun afsaltningen afdrypper trin til oprensning. Når mærket, QDs omviklet med et enkelt ptDNA (mQDs) binder til komplementære DNA-strenge, der bærer målretning domæner (f.eks benzylguanine (BG), benzylcytosine eller -alkylhalogenider).
Disse funktionaliteter målrette mQDs specifikt enzymatiske mærker, såsom SNAP CLIP & HALO, som er genetisk fusioneret til proteinet af interesse. Dette er en protokol til syntese, Målretning og live-cell imaging af mQDs produceret af sterisk udelukkelse.
Modularitet MQD design giver en øget grad af eksperimentel fleksibilitet. For eksempel kan en række mQDs hurtigt fremstilles i unikke farver giver mulighed for den samtidige afbildning af flere mål. Den målrettende sekvens ssDNA kan dirigere mQDs til proteiner, sukkerarter 12, lipider og overflader 13. En række enzymatiske tags er tilgængelige med ortogonale reaktiviteter, så flere mål, der skal afbildes samtidigt med differentielt målrettede mQDs. Ud over at koncentrere med SNAP-tag, var mærkning af target-proteiner med mQDs med clipsen tag, HALO tag, og biotinylerede proteiner også en succes. Denne protokol viser specifik mærkning af en overflade receptor på levende celler med disse mQDs, men protokollen kunne let tilpasses til en række forskellige sammenhænge.
Den betydelige metodisk indsigt i at producere mQDs med definerede valens er, at ~ 50 phosphorthioat-linkedbaser er forpligtet til at ombryde QDs (og dermed forhindre to molekyler binde samtidigt). En poly-A-S 50-sekvens reproducerbart og stabilt bundet 605 nm QDs fra Life Technologies. Selvom dette produkt er udgået, den steriske udelukkelse strategi er generaliseres til lignende produkter fra andre leverandører, der har forskellige størrelser, former, spektrale egenskaber.
Den effektivitet og stabilitet i ptDNA-indpakkede QDs afhænger kritisk på overfladen kemi og strukturen af QDs. Derfor vil succesen af en protokol afhænger af kommerciel kilde og kemiske struktur af QDs. Ved anvendelsen af denne protokol, findes der tre vigtige punkter forskel mellem forskellige kommercielle kilder QDs: en forskel i forhold, der er nødvendige for fase overførsel; en forskel i styrken af oprindelige PEG-thiol-ligand-binding, eventuelt hindrer forskydning af ptDNA; og en forskel i mængden af udsatte CdSe kerne, som kan leannonce til slukning af QD af MPEG-thiol faseoverførselsbetingelser.
Som for offentliggørelse, QDs med den bedste struktur for produktion af mQDs er 4-10 nm CdSe / ZnS kerne / skal QDs købt hos Life Technologies med emissionsspektre på 545, 585, 605 & 625 nm (figur 2A). QDs baseret på den "Levende" formulering (545, 605, etc.) af dæmpning ved tilsætning af mPEG thiol og er ikke egnede til denne anvendelse. QDs fra Aldrich og Ocean Nanotech fungerer godt, men kræver længere faseoverførselsbetingelser trin og forbehandling med trioctylphosphinoxid. Denne protokol er blevet optimeret til QDs fra Life Technologies.
Poly-A-phosphorthioat-sekvens anvendes til at indpakke QDs afsluttes med en nativ 20-mer DNA-hale indeholdende sekvensen (ACTG) 5 som en målsøgende streng kan hybridisere. Denne sekvens er praktisk, da det har lidt at ingen sekundær struktur, og vil forblive hybridized ved 37 ° C i PBS. Hvis der er adgang til en DNA-synthesizer, kan ptDNA af syntetiseret og derefter oprenset ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) under anvendelse af en C-8-søjle. Den ptDNA vil elueres senere på HPLC end tilsvarende oligonukleotider med en indfødt rygrad. Vi typisk forlader 5'DMT beskyttende gruppe på vores phosphorthioatoligonukleotider efter rensning.
Passivering af ptDNA-indpakkede QDs normalt kræves for at forbedre kolloid stabilitet QDs og reducere baggrunden bindende for de fleste eksperimentelle applikationer. Protokollen anvender en PEG-lag til at passivere de QDs. Carboxy PEG alkan thiol med ekstra PEG-enhed ((CO2H) CH2 O (CH2 CH2 O) 12 C 11 H 23 SH, carboxy-PEG12 alkan thiol) giver betydeligt reduceret baggrund, selvom længere PEG'er er både større, og generelt dyrere. mQDs overtrukket med carboxy PEG alkane thiol ligander er meget stabile i fysiologiske puffere, såsom phosphatpufrede saltopløsninger og dyrkningsmedier. Langtidsopbevaring (> 8 måneder) af mQDs ved 4 ° C viste ingen signifikant aggregering eller ptDNA detachement 11. Afhængigt af forsøget, PEG passivering af QDs alene ikke altid tilstrækkelig reducere ikke-specifik binding af mQDs. Inkubering begge celler og mQDs i phosphatpufret saltvand (PBS) indeholdende 3% BSA i 20 minutter før brug i det væsentlige reducerer ikke-specifik binding til celler, men det gør øge den tilsyneladende hydrodynamiske radius mQDs med ~ 50%. Passivering med 0,5% casein reducerer ikke-specifik binding yderligere, men det øger tilsyneladende størrelse i et større omfang end BSA.
5'-enden af en DNA-streng komplementær til mQDs kan modificeres for at muliggøre målretning af en række forskellige biomolekyler. Der er en række kendte teknikker til rådighed for kovalent modificere proteiner, lipids & sukker med enkeltstrenget DNA (ssDNA). Så længe ssDNA'et præsenteres ekstracellulært, er den tilgængelig for opløselige mQDs. mQDs med ovennævnte sekvenser vil hurtigt hybridisere med deres komplementære DNA-streng under celledyrkningsbetingelser. Der kan kræves en 10-20x poly (CT) spacer mellem ptDNA og den målsøgende sekvens for effektiv målretning, således at hæve bindende sekvens over den tykke og negativt ladede glycocalyx af cellen. Til denne protokol valgte vi at producere en BG-DNA med en komplementær sekvens af (CAGT) 5, som både vil hybridiseret til mQDs og kovalent knytte sig til en SNAP-tag protein til hurtig og specifik mærkning. En lignende protokol fungerer godt til at koble andre NHS-estere til amino-modificerede oligonukleotider.
For enkelt-molekyle billeddannelse, er en lav tæthed for mærkning typisk kræves for at løse de enkelte molekyler. En endelig MQD koncentration på ~ 0,5 nM i PBS med passiverende middeler et godt mål. Men disse høje fortyndinger resulterede somme tider i under-mærkning af cellerne. Hvis dette sker, kan yderligere MQD tilføjes indtil en optimal tæthed af mærkning overholdes. I tilfælde af SNAP-mærkede humane Notch1 koncentrationer> 10 nM MQD fremstillet tætte mærkning celler, mens 0,5 nM MQD resulterede i fastgørelse af ~ 20 mQDs på den basale overflade af målcellen (se figur 4B). Cellemærkning med mQDs var stærkt afhængig af konfluens af udpladede celler. Overdrevent konfluente celler ikke mærke på deres basale overflader.
Sammenfattende en simpel metode generere monovalente og modulære QDs blev beskrevet. Disse mQDs finde nytte i bred vifte af levende celle billedbehandlingsprogrammer, som påvist af imaging Notch receptoren på levende U2OS celler. Anvendeligheden af mQDs er ikke begrænset til dette specifikke tilfælde, men kan potentielt udvides til andre cellulære mål, såsom andre proteiner, nukleinsyrer og enzymer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), tilskud P50 GM081879 fra UCSF Center for Systemer og syntetisk biologi (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) og NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS blev støttet af Human Frontier Science Program tværfaglig postdoc forskning fællesskab.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |