We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
De dynamica van enkele moleculen op levende cellen bijdraagt aan hun biologische functie. Enkel molecuul fluorescentie beeldvorming is een populaire methode om enkel molecuul dynamiek op het celoppervlak 1,2,3 studeren. Echter, de meest gebruikte beeldvormende probes in deze studies enkele belangrijke nadelen. Bijvoorbeeld, conventionele organische kleurstoffen en fluorescerende eiwitten bieden een matige helderheid, ongeveer 10 5 -10 6 M -1 cm -1, maar zijn fotochemisch instabiel, bleken na de emissie van ongeveer 10 5 -10 6 fotonen onder typische live cell imaging voorwaarden 4,5. Daarentegen halfgeleider nanodeeltjes, vaak aangeduid quantum dots (QD), aanzienlijk helderder en stabieler met extinctiecoëfficiënten in het bereik van 10 -10 6 7 M -1 cm -1 en meer dan 10 7 -10 8 geëmitteerde fotonen voor photobleaching 5. De verbeterde helderheid en fotostabiliteit van QD's dan organische fluoroforen maakt de observatie van enkele moleculen tegen aanzienlijk hogere snelheden en over veel langere trajecten 6.
Ondanks hun voordelen en commerciële beschikbaarheid, hoofdelijk aansprakelijk blijven voor deze krachtige imaging agenten. Ten eerste hebben ze slecht gedefinieerde valentie gericht, hetgeen kan resulteren in verknoping gerichte biomoleculen 6. Ten tweede, ze hebben over het algemeen een grote hydrodynamische grootte (> 20 nm) dat de toegankelijkheid beperkt tot bepaalde drukke cellulaire omgevingen 7. Ten derde, zijn ze beperkt gericht modulariteit 7. Verschillende strategieën hebben geprobeerd om deze problemen 8,9,10 pakken, maar over het algemeen vereisen specifieke kennis en reagentia te implementeren.
Om deze problemen aan te pakken, meldde onlangs dat we een "Sterische Uitsluiting" strategie voor het bereiden van monovalente, klein, enmodulaire QD 11. De QD's zijn verpakt met een enkele lange phosphorothioate DNA (ptDNA) polymeer. De ptDNA bindt aan de QD oppervlak via meerdere Zn-S interacties tussen het oppervlak blootgestelde Zn atomen en fosforothioaat groepen van de ptDNA polymeer. Een enkele gebonden polymeer sterisch en elektrostatisch sluit de binding van extra middelen van het polymeer zonder aanzienlijke verhoging van het deeltje totale omvang (ongeveer 2 nm). Alle reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, worden gevormd in hoge opbrengst, en het proces vereist enige ontzouting stappen voor zuivering. Eenmaal gelabeld, QD's omwikkeld met een enkele ptDNA (mQDs) binden aan complementaire DNA-strengen dragende targeting domeinen (bijvoorbeeld benzylguanine (BG), benzylcytosine, of alkylhalogeniden).
Deze functionaliteiten gericht de mQDs specifiek enzymatische labels zoals SNAP, CLIP & HALO die genetisch gefuseerd met het eiwit van belang. Dit is een protocol voor de synthese, Targeting, en live-cell imaging van mQDs geproduceerd door sterische uitsluiting.
De modulariteit van het ontwerp MQD maakt een verhoogde mate van experimentele flexibiliteit. Bijvoorbeeld, een grote mQDs snel worden bereid in unieke kleuren waardoor gelijktijdige beeldvorming van meerdere doelen. De ssDNA targeting sequentie kan direct mQDs eiwitten, suikers 12, lipiden en oppervlakken 13. Een aantal enzymatische labels zijn verkrijgbaar met orthogonale reactiviteit, waardoor meerdere doelen tegelijk worden afgebeeld met verschillend gerichte mQDs. Naast het richten met de SNAP-tag, de etikettering van target eiwitten met mQDs behulp van de CLIP-tag, de HALO-tag, en gebiotinyleerde eiwitten was ook succesvol. Dit protocol toont de specifieke kenmerken van een oppervlak receptor op levende cellen met deze mQDs, maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om een aantal verschillende contexten.
De belangrijke methodologische inzicht produceren mQDs met gedefinieerde valentie is dat ~ 50 fosforothioaat-gebondenbasen moeten de QDs wrap (en dus dat twee moleculen binden tegelijkertijd). Een poly-A S 50 sequence reproduceerbaar en stabiel gebonden 605 nm QD's van Life Technologies. Hoewel dit product is niet meer leverbaar, de sterische uitsluiting strategie is generaliseerbaar naar soortgelijke producten van andere leveranciers met verschillende maten, vormen, spectrale eigenschappen.
De efficiëntie en de stabiliteit van ptDNA verpakte QD hoge mate afhankelijk van de oppervlakte chemie en de structuur van de QD's. Daarom zal het succes van een protocol afhankelijk zijn van de commerciële bron en de chemische structuur van de QD's. Voor de toepassing van dit protocol, drie belangrijke punten van verschil bestaan tussen de verschillende commerciële bronnen van QD's: een verschil in de voorwaarden die nodig zijn voor fase-overdracht; een verschil in de sterkte van oorspronkelijke PEG-thiol-ligand binding, belemmeren verschuiving met ptDNA; en een verschil in de hoeveelheid van de blootgestelde CdSe kern, die kunnen leadvertentie naar het blussen van de QD door de MPEG-thiol fasetransfer voorwaarden.
Zoals van publicatie, QD's met de beste structuur voor de productie van mQDs zijn 4-10 nm CdSe / ZnS kern / schil QD's gekocht bij Life Technologies met emissie-spectra bij 545, 585, 605 en 625 nm (Figuur 2A). QDs gebaseerd op de "Vivid" formulering (545, 605, etc.) quench na toevoeging van mPEG thiol en zijn niet geschikt voor deze toepassing. QD's van Aldrich en Ocean Nanotech werken goed, maar vereisen meer fasetransfer stappen en voorbehandeling met trioctylfosfine oxide. Dit protocol is geoptimaliseerd voor QD van Life Technologies.
De poly-A sequentie fosforothioaat gebruikt om de QDs wikkelen beëindigd met een natieve 20-meer DNA staart die de sequentie van (ACTG) 5 waaraan een targeting streng kan hybridiseren. Deze sequentie is handig, omdat het weinig of geen secundaire structuur, en blijft hybridized bij 37 ° C in PBS. Als er toegang tot een DNA synthesizer kan de ptDNA door gesynthetiseerd en vervolgens gezuiverd met omkeerfase sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC) met kolom C 8. De ptDNA zal later elueren op de HPLC dan vergelijkbare oligonucleotiden met een natieve backbone. We laten meestal de 5 'DMT-beschermende groep op onze fosforothioaatoligonucleotiden na zuivering.
Passivering van de ptDNA verpakte QD is meestal nodig om de colloïdale stabiliteit van QD's te verbeteren en de achtergrond bindend voor de meest experimentele toepassingen. Het protocol maakt gebruik van een PEG-laag om de QDs passiveren. Carboxy PEG alkaan thiol met extra PEG eenheden ((CO 2H) CH2-O (CH2 CH2 O) 12 C 11 H 23 SH, carboxy-PEG12 alkaan thiol) geeft significant verminderde achtergrond, hoewel de langere PEG beide groter, en algemeen duurder. mQDs gecoat met carboxy PEG alkane thiol liganden zeer stabiel in fysiologische buffers, zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossingen en kweekmedia. Langdurige opslag (> 8 maanden) van mQDs bij 4 ° C toonde geen significante aggregatie of ptDNA onthechting 11. Afhankelijk van het experiment, PEG passivering van de QDs alleen niet altijd voldoende niet-specifieke binding te verminderen van de mQDs. Incuberen beide cellen en mQDs in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 3% BSA gedurende 20 min vóór gebruik aanzienlijk vermindert niet-specifieke binding aan cellen, maar het verhoogt de schijnbare hydrodynamische radius van de mQDs met ~ 50%. Passiveren met 0,5% caseïne vermindert de niet-specifieke binding verder maar het verhoogt de schijnbare grootte in grotere mate dan BSA.
Uiteinde van een DNA-streng complementair aan de mQDs The 5 'kan worden aangepast targeting van een aantal verschillende biomoleculen mogelijk. Er zijn een aantal gevestigde technieken covalent eiwitten modificeren, lipids & suikers met enkelstrengs DNA (ssDNA). Zolang de ssDNA extracellulair wordt gepresenteerd, is het toegankelijk is voor oplosbare mQDs. mQDs de bovenvermelde sequenties snel hybridiseren met hun complementaire DNA-streng onder celcultuur condities. A 10-20x poly (CT) spacer tussen de ptDNA en targeting sequentie vereist voor efficiënt richten teneinde verheffen de bindende sequentie boven de dikke en negatief geladen glycocalyx van de cel. Voor dit protocol hebben we gekozen voor een BG-DNA te produceren met een complementaire sequentie van (CAGT) 5 die zowel gehybridiseerd met de mQDs en covalent zich koppelen aan een SNAP-tag eiwitten voor een snelle en specifieke etikettering. Een soortgelijk protocol functioneert goed voor het koppelen van andere NHS-esters met amino gemodificeerde oligonucleotiden.
Voor single-molecule imaging, is een lage dichtheid van etikettering normaal nodig is om individuele moleculen te lossen. Een laatste MQD concentratie van ~ 0,5 nM in PBS met passiveringsmiddelis een goed doelwit. Echter, deze hoge verdunningen soms resulteerde in onder-labeling van de cellen. Als dit gebeurt, kan extra MQD worden toegevoegd tot een optimale dichtheid van de etikettering wordt waargenomen. Bij SNAP-gelabeld humaan Notch1 concentraties van> 10 nM MQD geproduceerd dichte labeling cellen terwijl 0,5 nM MQD resulteerde in de hechting van ~ 20 mQDs het basale oppervlak van doelwitcel (zie figuur 4B). Cel labeling met mQDs was sterk afhankelijk van de samenvloeiing van de vergulde cellen. Overdreven samenvloeiende cellen niet labelen bij hun basale oppervlakken.
Kortom, een eenvoudige methode om monovalente genereren en modulaire QD beschreven. Deze mQDs vinden nut in breed scala van live cell imaging toepassingen, zoals aangetoond door de beeldvorming van de Notch receptor op live U2OS cellen. Toepasbaarheid van mQDs is niet beperkt tot dit specifieke geval, maar kan mogelijk worden verlengd andere cellulaire doelwitten zoals andere eiwitten, nucleïnezuren en enzymen.
The authors have nothing to disclose.
Financiering verstrekt door DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), subsidie P50 GM081879 van de UCSF Center for Systems and Synthetic Biology (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) en NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS werd ondersteund door Human Frontier Science Program interdisciplinair postdoc research fellowship.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |