We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
La dinamica di singole molecole sulle cellule vive contribuisce alla loro funzione biologica. Singola molecola di imaging di fluorescenza è un metodo popolare per studiare la dinamica di singola molecola sulla superficie cellulare 1,2,3. Tuttavia, le sonde di imaging più comunemente utilizzati in questi studi hanno diversi svantaggi importanti. Ad esempio, coloranti organici convenzionali e proteine fluorescenti garantiscono luminosità moderata, circa 10 5 -10 6 M -1 cm -1, ma sono fotochimica instabili, sbiancamento dopo l'emissione di circa 10 5 -10 6 fotoni in tipiche condizioni di imaging live-cell 4,5. Al contrario, le nanoparticelle di semiconduttori, spesso chiamati punti quantici (QD), sono significativamente più luminoso e più stabile, con coefficienti di estinzione nel range di 10 6 -10 7 M -1 cm -1 e superiore a 10 7 -10 8 fotoni emessi prima photoblNSEGNARE 5. La luminosità migliorata e fotostabilità di QD oltre fluorofori organici consente l'osservazione delle singole molecole a frame rate notevolmente più veloci e più ancora a lungo traiettorie 6.
Nonostante i loro vantaggi e disponibilità commerciale, alcune passività rimangono per questi potenti agenti di imaging. In primo luogo, essi hanno mal definito il targeting di valenza, che può provocare la reticolazione di biomolecole mirati 6. In secondo luogo, in genere hanno una grande dimensione idrodinamica (> 20 nm) che limita l'accessibilità per determinati ambienti affollati cellulari 7. In terzo luogo, essi hanno limitato il targeting modularità 7. Diverse strategie hanno tentato di affrontare questi problemi 8,9,10, ma in genere richiedono conoscenze e reagenti speciali implementare.
Per affrontare questi problemi, abbiamo recentemente riportato una strategia di "esclusione sterica" per la preparazione monovalente, piccolo, emodulari QD 11. I QD sono avvolti con un unico lungo DNA fosforotioato (ptDNA) polimero. Il ptDNA si lega alla superficie QD attraverso molteplici interazioni Zn-S tra gli atomi di Zn-superficie esposta ei gruppi fosforotioati del polimero ptDNA. Un unico polimero legato stericamente e elettrostaticamente esclude il legame di equivalenti aggiuntivi del polimero senza aumentare significativamente la dimensione complessiva della particella (circa 2 nm). Tutti i reagenti sono disponibili in commercio, i prodotti si formano in alto rendimento, e il processo richiede pochi passi dissalazione per la purificazione. Una volta etichettato, QD avvolto con un unico ptDNA (MQDS) si legano ai filamenti di DNA complementari recanti domini di targeting (ad esempio, benzylguanine (BG), benzylcytosine, o alkylhalides).
Queste funzionalità di mira i MQDS specificamente per tag enzimatici come la SNAP, CLIP & HALO che sono geneticamente fuse alla proteina di interesse. Questo è un protocollo per la sintesi, Targeting e live-cell imaging di MQDS prodotti per esclusione sterica.
La modularità del disegno dell'MQD consente una maggiore flessibilità sperimentale. Ad esempio, una varietà di MQDS può essere rapidamente preparato in colori unici consentano imaging simultaneo di più bersagli. La sequenza di targeting ssDNA può dirigere MQDS alle proteine, zuccheri, lipidi e 12 superfici 13. Un certo numero di tag enzimatiche sono disponibili con reattività ortogonali, consentendo a più obiettivi da essere ripreso in contemporanea con MQDS differenziale mirati. Oltre al targeting con il tag SNAP, l'etichettatura delle proteine bersaglio con MQDS utilizzando il tag CLIP, il tag HALO, e proteine biotinilati era anche successo. Questo protocollo dimostra la marcatura specifica di un recettore di superficie su cellule vive con questi MQDS, ma il protocollo può essere facilmente adattato a diversi contesti differenti.
L'intuizione metodologica significativo nella produzione MQDS con valenza definita è che ~ 50 fosforotioato-linkedle basi sono tenuti ad avvolgere i QD (e quindi evitare che due molecole di legarsi contemporaneamente). Una poli-Una sequenza S 50 riproducibile e stabilmente vincolata 605 nm QD da Life Technologies. Anche se questo prodotto è fuori produzione, la strategia di esclusione sterica è generalizzabile a prodotti simili di altri produttori che hanno diverse dimensioni, forme, le proprietà spettrali.
L'efficienza e la stabilità dei QD ptDNA-avvolto dipende in modo critico dalla chimica di superficie e la struttura dei QD. Pertanto, il successo di un protocollo dipenderà dalla struttura sorgente e la chimica commerciale dei QD. Ai fini del presente protocollo, tre grandi punti di differenza esiste tra le varie fonti commerciali di QD: una differenza nelle condizioni necessarie per il trasferimento di fase; una differenza nella forza di iniziale PEG-tiolo-ligando vincolante, eventualmente ostacolare lo spostamento dal ptDNA; e una differenza nella quantità di nucleo CdSe esposto, che può leannuncio a la tempra del QD dalle condizioni di trasferimento di fase tiolo Mpeg.
Come di pubblicazione, QD con la migliore struttura per la produzione di MQDS sono 4-10 nm QD CdSe / ZnS nucleo / guscio acquistati da Life Technologies con spettri di emissione a 545, 585, 605 e 625 nm (Figura 2A). QD basati sulla formulazione 'Vivid' (545, 605, ecc) estinguono dopo l'aggiunta di mPEG tiolo e non sono adatti per questa applicazione. QD da Aldrich e Ocean Nanotech funzionano bene, ma richiedono il trasferimento gradini e pre-trattamento con ossido trioctylphosphine fase più lunga. Questo protocollo è stato ottimizzato per QD da Life Technologies.
La sequenza poly-A fosforotioato utilizzato per avvolgere i QD termina con una coda di DNA di 20-mer nativo contenente la sequenza di (ACTG) 5 a cui un filamento di targeting può ibridare. Questa sequenza è conveniente, in quanto ha poca o nessuna struttura secondaria, e rimarrà hybridized a 37 ° C in PBS. Se vi è l'accesso a un sintetizzatore di DNA, il ptDNA può venire sintetizzato e poi purificato per cromatografia in fase inversa liquida ad alta prestazione (HPLC) utilizzando una colonna C 8. Il ptDNA si eluire in seguito alla HPLC di oligonucleotidi equivalenti con una spina dorsale nativo. Noi di solito lasciamo il 5 'DMT gruppo protettivo sui nostri oligonucleotidi fosforotioati dopo la purificazione.
Passivazione dei QD ptDNA-avvolto è di solito necessario per migliorare la stabilità colloidale del QD e ridurre vincolante per le applicazioni più sperimentali sfondo. Il protocollo utilizza un PEG-livello per passivare le QD. Carboxy PEG tiolo alcano con unità aggiuntive PEG ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, carbossi-PEG12 alcano tiolo) fornisce significativamente ridotto sfondo, anche se i PEG più lunghi sono entrambi più grandi, e generalmente più costosi. MQDS rivestiti con carbossi PEG alkaleganti tiolici ne sono altamente stabili nel buffer fisiologici come fosfato tamponata saline e terreni di coltura. Stoccaggio a lungo termine (> 8 mesi) di MQDS a 4 ° C non ha mostrato alcuna significativa aggregazione o ptDNA distacco 11. A seconda l'esperimento, PEG passivazione dei QD da sola non sempre sufficiente a ridurre legame non specifico delle MQDS. Incubare entrambe le cellule e MQDS in tampone fosfato salino (PBS) contenente il 3% di BSA per 20 minuti prima dell'uso sostanzialmente riduce legame non specifico per le cellule, anche se non aumentare il raggio idrodinamico apparente delle MQDS da ~ 50%. Passivazione con 0,5% di caseina riduce il legame non specifico ulteriormente ma aumenta la dimensione apparente in misura maggiore di BSA.
L'estremità 5 'di un filamento di DNA complementare ai MQDS può essere modificato per consentire il targeting di diverse biomolecole. Ci sono un certo numero di tecniche consolidate disponibili per modificare covalentemente proteine, lipids e zuccheri con DNA a singolo filamento (ssDNA). Finché il ssDNA viene presentato extracellulare, è accessibile a MQDS solubili. MQDS con le sequenze di cui sopra saranno rapidamente ibridare con il loro filamento di DNA complementare in condizioni di coltura cellulare. A 10-20x poli (CT) distanziale tra il ptDNA e la sequenza di targeting può essere richiesto per il targeting efficiente in modo da elevare la sequenza di legame sopra il glicocalice della cellula spessa e carica negativa. Per questo protocollo abbiamo scelto di produrre un BG-DNA con una sequenza complementare di (CAGT) 5 che sia ibridato ai MQDS e covalente si collegherà ad una proteina SNAP-tag per l'etichettatura rapida e specifica. A funzioni di protocollo simili anche per l'accoppiamento altre NHS-esteri di oligonucleotidi aminoacidi modificati.
Per l'imaging singola molecola, una bassa densità di etichettatura è in genere necessario per risolvere singole molecole. Una concentrazione finale MQD di ~ 0,5 nM in PBS con l'agente passivanteè un buon obiettivo. Tuttavia, queste diluizioni elevate talvolta portato a sotto-etichettatura delle cellule. In questo caso, ulteriore MQD possono essere aggiunti fino a quando si osserva una densità ottimale di etichettatura. Nel caso di SNAP-tag Notch1 umano, concentrazioni> 10 nM MQD prodotte cellule di etichettatura dense mentre 0,5 nM MQD portato l'attaccamento di ~ 20 MQDS sulla superficie basale della cellula bersaglio (vedi Figura 4B). Etichettatura delle cellule con MQDS era altamente dipendente dalla confluenza delle cellule placcato. Eccessivamente cellule confluenti non etichettare a loro superfici basali.
In sintesi, un metodo semplice per generare monovalenti e QD modulari è stato descritto. Questi MQDS trovano utilità in un'ampia gamma di applicazioni di imaging cellulare dal vivo, come dimostra l'imaging del recettore Notch sulle cellule U2OS dal vivo. Applicabilità MQDS non è limitata a questo caso specifico, ma può essere potenzialmente estesa per altri bersagli cellulari come altre proteine, acidi nucleici, ed enzimi.
The authors have nothing to disclose.
Finanziamento previsto dal DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), concessione P50 GM081879 dal Centro UCSF per sistemi e Biologia Sintetica (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) e NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS è stato sostenuto da Human Frontier Science Program Cross postdoc disciplinare Research Fellowship.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |