We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Canlı hücreler üzerinde tek moleküllerin dinamikleri biyolojik işlevine katkıda bulunur. Tek molekül floresan görüntüleme hücre yüzey 1,2,3 üzerinde tek bir molekül dinamiklerini incelemek için popüler bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu çalışmalarda en yaygın olarak kullanılan görüntüleme sondaları, birçok önemli dezavantajları vardır. Örneğin, geleneksel organik boyalar ve floresan proteinleri 1 ila yaklaşık 10 5 -10 6 M, cm -1 orta parlaklık sağlar, ancak fotokimyasal olarak dengesiz olan, tipik bir canlı hücre görüntüleme koşulları altında yaklaşık 10 5 -10 6 foton emisyonu sonra ağartıcı 4,5. Buna karşın, yarı iletken nanopartiküller, sık aranan kuantum nokta (QDS), 6 10 -10 7 M-1 cm-1 aralığında ve photobl önce 10 7 -10 8 fotonların aşılmasına imha katsayıları olan, çok daha parlak ve daha kararlıdır5 eaching. Organik Flüoroforlann üzerinde QDS geliştirilmiş parlaklık ve fotostabilite önemli ölçüde daha hızlı kare hızında tek moleküllerin gözlem ve çok daha uzun 6 yörüngeleri sağlar.
Kendi avantajları ve ticari varlığına rağmen, çeşitli yükümlülükler bu güçlü görüntüleme ajanları için kalır. Birincisi, onlar kötü hedeflenen biyomoleküllerin 6 çapraz bağlantı neden olabilir hedefleme değerliği, tanımlanmış. İkincisi, genellikle belirli kalabalık hücresel ortamlarda 7 erişilebilirlik sınırlayan büyük bir hidrodinamik boyut (> 20 nm) sahip. Üçüncüsü, modülerlik 7 hedefleme sınırlıdır. Çeşitli stratejiler bu sorunların 8,9,10 değinmeye çalıştık, ama genellikle uygulamak uzmanlaşmış bilgi ve reaktifler ihtiyaç var.
Bu sorunları çözmek için, son zamanlarda tek değerli, küçük hazırlanması için bir "Siterik Dışlama" stratejisi rapor veModüler QDS 11. QDS tek bir uzun fosforotioat DNA'sı (ptDNA) polimeri ile birlikte sarılır. PtDNA yüzeye maruz kalan çinko atomu ve ptDNA polimerin fosforotioat grup arasında çoklu, Zn-S etkileşimler yoluyla QD yüzeyine bağlanır. Tek bir polimer bağlı sterik ve elektrostatik olarak önemli ölçüde partikülün toplam boyutu (yaklaşık 2 nm) arttırmadan, polimerin ilave eşdeğerlerinin bağlayıcı içermez. Tüm reaktifler ürünler yüksek verimle oluşturulmuştur, ticari olarak temin edilebilir, ve bu işlem saflaştırılması için sadece tuz giderme adımları gerektirir. Bir kez, hedef etki (örneğin, benzilguanin (BG), benzylcytosine veya alkilhalidlerin) taşıyan tamamlayıcı DNA ipliklerini tek bir ptDNA (MQDS) bind ile sarılmış QDS etiketlenmiş.
Bu işlevler genetik ilgilenilen protein ile birleştirildiği bir hamlede, CLIP, ve halo gibi enzimatik etiketler özel olarak hedef MQDS. Bu sentez için kullanılan bir protokoldür, Hedefleme ve sterik dışlama tarafından üretilen MQDS canlı hücre görüntüleme.
MQD'nin tasarım modülerlik deneysel esneklik artan bir derecede sağlar. Örneğin, MQDS çeşitli hızla birden fazla hedefin aynı anda görüntülenmesi için izin benzersiz renk hazırlanabilir. SsDNA hedef sekansı, proteinlere şeker 12, lipidler MQDS yönlendirmek ve 13 yüzeyleri edebilirsiniz. Enzimatik etiketleri bir dizi çoklu hedefleri farklı olarak hedeflenen MQDS ile aynı anda görüntülü sağlayan, dik reaktivitelerinin mevcuttur. SNAP etiketiyle hedefleme ek olarak, CLIP etiketi HALO etiketi kullanılarak MQDS ve biyotinile edilmiş proteinleri ile hedef proteinlerin etiketleme de başarılı olmuştur. Bu protokol, bu MQDS canlı hücreler üzerinde bir yüzey reseptörünün özel işaretlemeyi açık olarak gösteren, ancak protokol kolay bir şekilde farklı bağlamlarda bir dizi uyarlanabilir.
Tanımlı değerliği ile MQDS üretiminde önemli metodolojik fikir olduğunu ~ 50 fosforotıyoat bağlantılıbazlar QDS sarın (ve dolayısıyla aynı zamanda bağlanma için iki moleküllerinin önlenmesi) için gereklidir. Bir poli-A S 50 dizisi yeniden üretilebilir ve kararlı biçimde Life Technologies'den 605 nm QDS bağlandı. Bu ürün üretilmiyor olmasına rağmen, sterik dışlama stratejisinin farklı boyutlarda, şekiller, spektral özelliklere sahip diğer satıcılardan benzer ürünlere genellenebilir.
PtDNA sarılmış QDS etkinliği ve stabilitesi QDS yüzey kimyası ve yapısının kritik bağlıdır. Bu nedenle, bir protokol başarısı QDS ticari bir kaynağı, kimyasal yapıya bağlı olacaktır. Bu protokolün amaçları için, farkı üç ana puan QDS çeşitli ticari kaynaklardan arasındaki mevcut: faz transferi için gerekli koşulların bir fark; ptDNA tarafından ön PEG-tiol-ligandı bağlanma muhtemelen engelleyen değiştirme mukavemetinde bir farktır; ve maruz CdSe çekirdeğin miktarda bir fark, bu yararlı bir LemPEG tiol, faz aktarım koşulları ile QD soğutulması için reklam.
Yayın tarihi itibariyle MQDS üretimi için en iyi yapı ile QDS 545, 585, 605 ve 625 nm (Şekil 2A) emisyon spektrumu ile Life Technologies'den satın alınan 4-10 nm CdSe / ZnS çekirdek / kabuk QDS bulunmaktadır. 'Canlı' formülasyon (545, 605, vb) bağlı olarak QDS mPEG tiol eklenmesi ile söndürülmüş ve bu uygulama için uygun değildir. Aldrich ve Okyanus Nanotech.'in gelen QDS iyi çalışır, ancak daha uzun faz transfer adımları ve trioctylphosphine oksit ile ön hazırlık gerektirmez. Bu protokol, Life Technologies'den QDS için optimize edilmiştir.
QDS sarmak için kullanılan Poli-A fosforotioat sekansı, hedef iplik hibridize kalabileceği (ACTG) 5 dizisini içeren bir doğal 20-mer, DNA kuyruk ile sonlandırılır. Bu dizi sekonder yapısına az olduğu gibi, uygundur ve hybridiz kalacakPBS içinde 37 ° C'de ed. Bir DNA sentezleyicisi ile erişim mümkün değilse, bir Cı-8 ptDNA kolonu kullanılarak sentezlenebilir ve daha sonra ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmıştır olabilir. PtDNA yerli omurga ile eşdeğer oligonükleotitlerden daha HPLC daha sonra Zehir. Bu tipik olarak saflaştırma sonrası fosforotioat oligonükleotitlerin koruma grubu ile DMT, '5 bırakın.
PtDNA sarılmış QDS pasifleştirme genellikle QDS peltelenmiş kararlılığını iyileştirmek ve deneysel uygulamalar için bağlayıcı arka planı azaltmak için gereklidir. Protokol QDS pasifleştirilmesi için bir PEG-katmanı kullanır. Karboksi PEG ilave PEG birimlerinin sahip alkan tiyol ((CO 2H) CH2 O (CH2 CH2 O) C 12 11, H 23, SH karboksi-PEG12 alkan tiyol) belirgin bir azalma sağlamaktadır arka uzun PEG hem de daha büyük olmasına rağmen, ve genellikle daha pahalı. karboksi PEG alka kaplanmış MQDSNE tiol ligandlar örneğin fosfat tamponlu salines ve kültür ortamı olarak fizyolojik tamponların son derece stabildir. 4 ° C'de MQDS uzun süreli saklama (> 8 ay) belirgin ve toplanmasını ptDNA dekolmanı 11 göstermiştir. Deney bağlı olarak, QDS PEG pasivasyon, tek başına her zaman yeterli miktarda spesifik-olmayan bağlanmasını MQDS azaltmaz. Bu ~% 50 MQDS belirgin hidrodinamik yarıçapını artırmak yok ama esas olarak kullanımdan önce 20 dakika süreyle% 3 BSA ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücreleri ve hem de kuluçkaya MQDS hücrelere spesifik olmayan bağlanma azaltır. % 0.5 kasein ile pasifleştirilmesi spesifik olmayan bağlanma daha da azaltır ama BSA göre daha büyük bir ölçüde belirgin boyutunu artırır.
MQDS tamamlayıcı bir DNA kolunun 5 'ucu, farklı biyomoleküllerin bir dizi hedef sağlamak için modifiye edilebilir. Kovalent proteinlerin modifiye edilmesi için bilinen teknikler kullanılabilir bir dizi L. varipids ve tek kordonlu DNA (ssDNA) ile şeker. SsDNA ekstraselüler sunulmuştur sürece, o çözünebilir MQDS erişilebilir. yukarıdaki dizilerin ile MQDS hızlı hücre kültürü koşulları altında tamamlayıcı DNA bağından ile hibridize olur. Hücrenin kalın ve negatif yüklü glikokaliksin yukarıdaki bağlama sekansı yükseltecek şekilde ptDNA ve hedefleme dizisi arasında bir 10-20x poli (BT) boşluk hedefleme etkin için gerekli olabilir. Bu protokol için biz de MQDS hibridize kovalent hızlı ve spesifik etiketleme için SNAP-işareti proteiniyle kendini bağlamayı (CAGT) içindeki bir 5 tamamlayıcı dizisi ile bir BG-DNA üretilmesi için seçtik. De amin ile modifiye edilmiş oligonükleotitler, NHS-esterlerin bağlanması için benzer bir protokol işlevleri.
Tek molekül görüntüleme için, etiketleme, düşük bir yoğunluğu, genellikle tek tek oluşturucu moleküllerin çözmek için gereklidir. Pasifleştirme maddesi ile PBS içinde ± 0.5 nM'lik bir son konsantrasyon MQDiyi bir hedeftir. Bununla birlikte, bu yüksek dilüsyonlar bazen altında etiketleme hücreleri ile sonuçlanmıştır. Böyle bir durumda etiketleme optimum yoğunluk gözlenene kadar, ek MQD eklenebilir. 0.5 nM MQD'nin hedef hücrenin basal yüzeyinde 20 MQDS (Şekil 4B 'ye bakınız) ~ ekinde sonuçlanırken, SNAP-etiketli insan Notch1 durumunda,> 10 nM MQD'nin konsantrasyonları yoğun etiketleme hücresinde üretilir. MQDS ile hücre etiketleme kaplı hücreler konfluansa yüksek ölçüde bağlı idi. Aşırı birleşen hücreler bazal yüzeylerinde etiket yok.
Özetle, tek değerli basit bir yöntem elde etmek ve modüler QDS tanımlanmıştır. Canlı U2OS hücreleri üzerindeki Çentik alıcısı görüntüleme ile gösterildiği gibi bu MQDS, canlı hücre görüntüleme uygulamaları geniş kullanım alanı bulur. MQDS Uygulanabilirliği Bu özel durumda ile sınırlı değildir, ancak potansiyel olarak bu tür diğer proteinler, nükleik asitler ve enzimler gibi diğer hücresel hedefler için uzatılabilir.
The authors have nothing to disclose.
DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), Sistemler için ucsf Merkezi ve Sentetik Biyoloji (ZJG) hibe P50 GM081879, NIH 5R21EB015088-02 (YJ) ve NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ) tarafından sağlanan finansmanın transferi. DS İnsan Frontier Bilim Programı Çapraz disiplin doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |