Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lysine méthylation est une modification post-traduction émergent et il a été identifié sur plusieurs protéines histones et non-histones, où il joue un rôle crucial dans le développement des cellules et de nombreuses maladies. Environ 5 000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines, qui sont fixés par quelques douzaines de protéines méthyltransférases de lysine. Ceci suggère que chaque PKMT méthylation de multiples protéines, mais jusqu'à présent, seulement un ou deux substrats ont été identifiés pour plusieurs de ces enzymes. Analyse réseau de peptides Pour aborder ce problème, nous avons introduit la spécificité de substrat à base de PKMTs. Tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser la spécificité de PKMTs parce méthylation de plusieurs substrats avec différentes séquences peut être testée sur un réseau. Nous avons synthétisé tableaux peptidiques sur membrane de cellulose en utilisant un synthétiseur Intavis SPOT et analysé la spécificité des différents PKMTs. Basé sur les résultats, pour plusieurs de ces enzymes, romanubstrates pu être identifiés. Par exemple, en employant pour NSD1 matrices de peptides, nous avons montré qu'il méthylation H4 K44 de la place de la H4K20 rapporté et en outre le substrat H1.5K168 est hautement préféré sur la H3K36 précédemment connu. Par conséquent, les tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser biochimiquement les PKMTs.
Introduction
Dans les deux dernières décennies, plusieurs rapports ont démontré l'importance des modifications post-traductionnelles (PTM) dans le développement cellulaire et plusieurs maladies comme le cancer, mais récemment protéines lysine méthylation a émergé comme une autre PTM vitale. Alors qu'initialement la méthylation des histones de la lysine a été jugée une marque essentielle de la chromatine, travail plus tard a également montré lysine méthylation de plusieurs protéines non-histones 1-4. Le transfert séquentiel des groupes méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine dans le groupe des résidus de lysine ε-amino est catalysée par une famille d'enzymes appelée protéine Lysine méthyltransférases (PKMTs) qui contient plus de 60 protéines dans le génome humain. PKMTs ont d'abord découvert que la modification des histones enzymes qui méthylate résidus de lysine spécifique, mais des rapports ultérieurs ont démontré qu'elles pouvaient aussi méthylation des protéines non-histones 5. Jusqu'à présent, environ 5000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines 6 </sinscrire>, mais les enzymes responsables de ces modifications sont souvent pas identifiés. Une raison à cela est que la spécificité de la plupart des PKMTs n'a pas été étudié en profondeur. Par conséquent, il se produit de façon récurrente que de nouveaux substrats de PKMTs sont découverts. L'absence d'une connaissance détaillée de la spécificité de substrat de PKMTs entrave la compréhension de leur fonction biologique et son rôle. Pour étudier la spécificité d'un PKMT en détail, les taux de plusieurs substrats peptidiques qui diffèrent par une ou quelques acides aminés méthylation doivent être mesurées et comparées, qui est idéalement effectuée en utilisant des réseaux de peptides. Basé sur les profils de spécificité résultant, substrats potentiels de PKMTs peuvent être identifiés qui peuvent être étudiées plus loin.
matrices de peptides sont des outils largement utilisés pour l'analyse biochimique des anticorps, des peptides et des enzymes de modification de la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine (anticorps-antigène, récepteur-ligand) 9.7. Plusieurs centaines de peptides sont nécessaires pour Such applications. Différentes méthodes sont disponibles pour la synthèse des peptides, parmi lesquels Peptide Synthesis de résine est très couramment utilisée, mais elle présente des limites du débit et il est relativement coûteux. Ces problèmes ont été résolus avec l'introduction de la méthode de synthèse SPOT par Frank et ses collègues 10. Procédé de synthèse SPOT permet la synthèse de plusieurs centaines de peptides en parallèle et, en moyenne, il est peu coûteux par rapport à la synthèse de la résine. Les peptides synthétisés sur membrane de cellulose peuvent être utilisées soit directement pour diverses applications ou des peptides peut être clivé à partir de la membrane et utilisés comme peptides libres dans les analyses en solution ou pour préparer des puces à peptides 10-13.
Synthèse SPOT est une variante de la synthèse peptidique en phase solide, qui utilise une membrane de cellulose comme support solide et emploie la chimie classique Fmoc-10-13. Par conséquent, la synthèse des chaînes de peptides à partir de l'extrémité C-terminale et se dirige versl'extrémité N-terminale à la différence de la synthèse biologique des ribosomes. Les membranes de cellulose sont fonctionnalisées pour la fixation du premier amino-acides activés (Fig. 1). Procédé SPOT est basé sur la livraison séquentielle des acides aminés activés dans une gouttelette de solvant à des endroits définis sur la membrane en utilisant un système de pipetage automatisé. La gouttelette de liquide est distribué sur la membrane poreuse, où il forme une tache humide circulaire, qui agit ensuite comme un réacteur ouvert pour les réactions chimiques dans la synthèse des peptides. La taille du spot est déterminée par le volume distribué et la capacité d'absorption de la membrane, des multiples de ces taches sont disposées en rangées. L'échelle de la synthèse en corrélation avec la taille de la place et la capacité de chargement de la membrane. La distance entre les points et la densité de réseaux sont gérés en faisant varier les tailles de spot. membrane de cellulose a plusieurs avantages en tant que phase solide dans la synthèse peptidique, il est peu coûteux, tolérant à la chemicals utilisés en synthèse peptidique, dans des solutions aqueuses stables et faciles à manipuler. De plus, sa nature hydrophile rend approprié pour plusieurs systèmes d'analyse biologique. synthèse de SPOT peut être effectuée manuellement ou automatisé (pour 1000s des peptides) selon le nombre requis de peptides. Un synthétiseur de SPOT entièrement automatisé de Intavis (Köln, Allemagne) est utilisé pour nos applications. Il permet la synthèse de peptides en différentes quantités et de longueur différente. Peptides linéaires sont régulièrement synthétisés avec 15 à 20 amino acides de longueur, dans les peptides d'addition de jusqu'à 42 acides aminés peuvent également être préparés par synthèse par étapes 14,15. Cependant, l'augmentation du nombre d'acides aminés conduit à des réductions des rendements de couplage ensemble, ce qui affecte la qualité des peptides. En raison de la faible quantité de peptides par point, les produits sont souvent difficiles à purifier et la qualité de peptides individuels ne peuvent pas être facilement évalués. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de SPOT Peptide matrices doivent être confirmées, soit avec des peptides synthétisés par des procédés standard à plus grande échelle, qui peuvent être purifiés et analysés selon les normes en synthèse peptidique ou par la synthèse des protéines contenant les séquences peptidiques souhaitées. Pourtant, nous avons trouvé la synthèse de SPOT pour être très fiable et des résultats généralement être reproductible. synthèse SPOT est pas limitée aux acides aminés protéinogènes, plusieurs acides aminés modifiés disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour la synthèse, ce qui permet peptides à être modifiés avant et après le clivage final du groupe de protection de chaîne latérale et, en outre, elle permet également l'incorporation de acides aminés phosphorylés, méthylés ou acétylés 11.
Des banques de peptides immobilisés synthétisés par la méthode Spot peuvent être directement utilisés pour de nombreuses analyses biologiques et biochimiques. Nous avons utilisé des réseaux peptidiques comprenant les peptides 300-400 pour étudier la spécificité de substrat de PKMTs. Pour modifi enzymatiquecation, les matrices de peptides sont incubés avec la PKMT respectif et étiqueté [méthyl-3H] -AdoMet dans un tampon approprié. La méthylation du substrat respectif est analysé par la suite du transfert enzymatique des groupes méthyle à marqueur radioactif de l'AdoMet pour le substrat peptidique par autoradiographie (fig. 3). Par ce procédé, les tableaux peptidiques permettent l'étude de la méthylation de différents substrats peptidiques en même temps. Un avantage important de ce procédé est que tous les peptides sont méthylés en compétition, de telle sorte que pendant la phase linéaire de la cinétique de méthylation, la méthylation relative de chaque peptide est proportionnelle à la constante de vitesse catalytique divisée par la constante de dissociation (k cat / K D) de l'enzyme pour le substrat peptidique respective. Par conséquent, la quantité de radioactivité incorporée dans chaque spot est directement corrélée à l'activité enzymatique vers le peptide particulier. Utilisation de larésultats d'une expérience de méthylation de réseau peptidique, le profil de spécificité de la PKMT peuvent être définis et sur cette base de nouveaux substrats peut être fondée. Matrices peptidiques permettent la validation rapide et efficace et de coût de la méthylation de nouveaux substrats au niveau des peptides. Pour cela, on prépare des tableaux qui contiennent les nouveaux substrats prédites avec des peptides modifiés contenant une Ala à la place de Lys à des sites cibles ainsi que les peptides témoins positifs et négatifs. Enfin, les nouveaux substrats peuvent être préparés comme des protéines ainsi que des mutants, dans lequel la cible Lys est modifiée à Ala et la méthylation peut être confirmée au niveau de la protéine. Selon les résultats, ce est alors suivi par des études biologiques portant sur les rôles potentiels de la méthylation des substrats protéiques nouvellement décrites.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPOT synthesis tel que décrit ici est une méthode puissante pour cartographier les sites d'interaction protéine-protéine et d'enquêter sur la reconnaissance de substrat de peptide enzymes de modification. Cependant, la synthèse SPOT a encore certains inconvénients, car bien que les peptides synthétisés par la méthode de SPOT sont signalés à avoir plus de 90% de pureté 21 ce est difficile de confirmer dans chaque cas. Par conséquent, les résultats doivent être reproduits par d'autre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Referências
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