Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lysine methylering is een nieuwe post-translatie modificatie en is geïdentificeerd verschillende histon en niet histon eiwitten, waar het speelt cruciale rol in celontwikkeling en vele ziekten. Circa 5000 lysine methylatie sites werden geïdentificeerd op verschillende eiwitten, die door enkele tientallen eiwit lysine methyltransferases zijn ingesteld. Dit suggereert dat elke PKMT methyleert meerdere eiwitten echter tot nu toe slechts één of twee substraten geïdentificeerd voor verscheidene van deze enzymen. Om dit probleem aan te pakken, hebben we geïntroduceerd peptide array gebaseerde substraat specificiteit analyses van PKMTs. Peptide arrays zijn krachtige instrumenten om de specificiteit van PKMTs karakteriseren omdat methylatie van diverse ondergronden met verschillende sequenties kunnen worden getest op een array. We gesynthetiseerd peptide arrays op cellulosemembraan met behulp van een Intavis SPOT synthesizer en de specificiteit van de verschillende PKMTs geanalyseerd. Op basis van de resultaten voor een aantal van deze enzymen, nieuwe substrates konden worden geïdentificeerd. Bijvoorbeeld voor NSD1 door gebruik peptide arrays hebben we aangetoond dat het methyleert K44 van H4 plaats van de gerapporteerde H4K20 en bovendien H1.5K168 is het substraat sterk de voorkeur boven de eerder bekende H3K36. Vandaar peptide arrays zijn krachtige tools om biochemisch karakteriseren de PKMTs.
Introduction
In de laatste twee decennia, verschillende rapporten het belang aangetoond van post-translationele modificaties (PTM) in cellulaire ontwikkeling en verschillende ziekten zoals kanker, maar onlangs eiwit lysine methylatie heeft ontpopt als een ander vitaal PTM. Terwijl aanvankelijk histon lysine methylering bleek een essentiële chromatine merk zijn latere werk toonde ook lysine methylatie van verschillende non-histon-eiwitten 1-4. De sequentiële overdracht van methylgroepen van S-adenosyl-L-methionine de ε-aminogroep van lysineresten wordt gekatalyseerd door een familie van enzymen genaamd Protein Lysine methyltransferase (PKMTs) dat meer dan 60 eiwitten in het menselijk genoom. PKMTs werden oorspronkelijk ontdekt als histon-modificerende enzymen die specifiek lysine residuen methyleren maar later rapporten aangetoond dat zij ook kunnen methyleren niet-histon-eiwitten 5. Tot nu werden ongeveer 5000 lysine methylatie locaties die op verschillende proteïnen 6 </sup>, maar de enzymen verantwoordelijk voor deze wijziging zelden beschouwd. Een reden hiervoor is dat de specificiteit van meest PKMTs niet uitgebreid onderzocht. Daarom is het herhaaldelijk gebeurt dat nieuwe substraten van PKMTs worden ontdekt. Het ontbreken van een gedetailleerde kennis van het substraat specificiteit van PKMTs belemmert begrip van hun biologische functie en rol. Om de specificiteit van een PKMT in detail te onderzoeken, moet de methylering percentages vele peptidesubstraten die verschillen in één of enkele aminozuren worden gemeten en vergeleken, die idealiter geschiedt middels peptide arrays. Op basis van de verkregen specifieke profielen, kunnen mogelijke substraten van PKMTs worden geïdentificeerd die verder kunnen worden onderzocht.
Peptide arrays worden veel gebruikt hulpmiddelen voor biochemische analyse van antilichamen, peptide modificerende enzymen en in kaart brengen van eiwit-eiwit interactie plaatsen (antilichaam-antigeen, receptor-ligand) 7-9. Enkele honderden peptiden zijn nodig voor such toepassingen. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor peptidesynthese, waaronder peptidesynthese op hars wordt zeer algemeen gebruikt, maar heeft beperkingen op doorvoer en is relatief duur. Deze problemen werden opgelost met de introductie van de SPOT-synthesewerkwijze van Frank en collega 10. Werkwijze SPOT synthese laat synthese van honderden peptiden in parallel en gemiddeld is goedkoop in vergelijking met hars synthese. De peptiden gesynthetiseerd op cellulose membraan kan direct worden gebruikt voor diverse toepassingen of peptiden kunnen worden afgesplitst van het membraan en gebruikt als vrije peptiden in oplossing assays of peptide microarrays 10-13 bereiden.
SPOT-synthese is een variant van de vaste fase peptidesynthese, die een cellulose membraan als een vaste drager gebruikt en gebruikt de standaard Fmoc-chemie 10-13. Vandaar de synthese van peptideketens begint bij het C-terminale uiteinde en verloopt naarhet N-terminale uiteinde in tegenstelling tot de biologische synthese van ribosomen. Cellulose membranen worden gefunctionaliseerd voor bevestiging van de eerste geactiveerde aminozuren (Fig. 1). De SPOT methode is gebaseerd op de sequentiële afgifte van geactiveerde aminozuren in een druppel oplosmiddel gedefinieerde vlekken op het membraan met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem. De druppel vloeistof wordt afgegeven aan het poreuze membraan vormt daar een cirkelvormige natte plek, die later fungeert als een open reactor voor chemische reacties in peptidesynthese. De vlekgrootte wordt bepaald door het gedoseerde volume en de absorptiecapaciteit van het membraan, wordt een veelvoud van dergelijke plaatsen gerangschikt als arrays. De schaal van de synthese correleert met de spotgrootte en de belastbaarheid van het membraan. De afstand tussen de spots en de dichtheid arrays worden beheerd door het variëren van de vlekgroottes. Cellulose membraan heeft verscheidene voordelen zoals vaste fase peptidesynthese, is goedkoop, tolerant voor de chemieALS in peptidesynthese stabiel in waterige oplossingen en gemakkelijk te hanteren. Daarnaast zijn hydrofiele aard maakt het voor verscheidene biologische testsystemen. SPOT synthese kan handmatig worden uitgevoerd of geautomatiseerd (voor 1000 van peptiden) afhankelijk van het vereiste aantal peptiden. Een volledig geautomatiseerde SPOT synthesizer van Intavis (Köln, Duitsland) wordt gebruikt voor onze toepassingen. Het maakt de synthese van peptiden in verschillende hoeveelheden en verschillende lengte. Lineaire peptiden regelmatig gesynthetiseerd met 15 tot 20 aminozuren lang, bovendien peptiden van maximaal 42 aminozuren kunnen ook worden bereid door stapsgewijze synthese 14,15. Echter, het verhogen van het aantal aminozuren leidt tot een vermindering van de totale koppelingsopbrengsten, die de kwaliteit van de peptiden beïnvloedt. Vanwege de kleine hoeveelheid peptiden per vlek, de producten zijn vaak moeilijk te zuiveren en de kwaliteit van de afzonderlijke peptiden niet gemakkelijk worden beoordeeld. Daarom zijn de resultaten verkregen uit SPOT Peptide arrays worden bevestigd hetzij peptiden gesynthetiseerd door standaard werkwijzen in grotere schaal, die kan worden gezuiverd en volgens de normen peptidesynthese of door het synthetiseren van de eiwitten die het gewenste peptide sequenties geanalyseerd. Toch vonden we de SPOT synthese zeer betrouwbaar te zijn en leidt doorgaans reproduceerbaar te zijn. SPOT synthese niet beperkt tot aminozuren, diverse commercieel verkrijgbare gemodificeerde aminozuren kan ook worden gebruikt voor synthese proteïnogene, waardoor peptiden te modificeren vóór en na de uiteindelijke splitsing van de zij keten beschermingsgroep en bovendien het laat ook incorporatie van gefosforyleerd, gemethyleerd of geacetyleerd aminozuren 11.
Geïmmobiliseerde peptidebibliotheken gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze kan direct worden gebruikt voor vele biologische en biochemische assays. We gebruikten peptide arrays omvattende 300-400 peptiden aan de substraatspecificiteit van PKMTs onderzoeken. Voor enzymatische wijzikation, worden de peptide arrays geïncubeerd met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl- 3H] -AdoMet in een geschikte buffer. De methylering van de desbetreffende substraat wordt geanalyseerd door de enzymatische overdracht van het radioactief gemerkte methylgroepen van AdoMet het peptidesubstraat door autoradiografie (Fig. 3). Door deze procedure het peptide arrays mogelijk de studie van methylering van verschillende peptide- substraten tegelijk. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat alle peptiden gemethyleerd in competitie, zodanig dat gedurende de lineaire fase van de methylering kinetiek, de relatieve methylering van elk peptide is evenredig met de katalytische snelheidsconstante gedeeld door de dissociatie constante (k cat / K D) van het enzym voor de betreffende peptidesubstraat. Daarom wordt de hoeveelheid radioactiviteit opgenomen in elke plek direct gecorreleerd met de enzymatische activiteit voor de specifieke peptide. DeResultaten van een peptide-array methylering experiment, kan het specifieke profiel van de PKMT worden bepaald en op basis van deze nieuwe substraten kan worden gegrond. Peptide arrays kan de snelle en kostenefficiënte validatie van de methylering van nieuwe substraten op de peptide-niveau. Hiervoor worden arrays voorbereid dat de voorspelde roman substraten samen met gewijzigde peptiden met een Ala in plaats van Lys op het doel bezienswaardigheden, evenals de positieve en negatieve controle peptiden bevatten. Tenslotte kunnen de nieuwe substraten worden bereid eiwitten met mutanten, waarbij het doel Lys veranderd naar Ala en de methylering kan worden bevestigd op het eiwitniveau. Afhankelijk van de resultaten, dit wordt gevolgd door biologische onderzoeken naar mogelijke rol van de methylering van de nieuw beschreven eiwitsubstraten.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPOT synthese zoals hier beschreven is een krachtige methode om eiwit-eiwit interactie plaatsen in kaart en onderzoekt de substraatherkenning van peptide modificerende enzymen. Echter, SPOT-synthese nog steeds bepaalde nadelen, want hoewel de peptiden gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze worden gerapporteerd aan meer dan 90% zuiverheid 21 hebben dit moeilijk te bevestigen telkens. Derhalve resultaten te worden overgenomen door andere werkwijzen bijvoorbeeld gebruik eiwitdomeinen of gezuiverde peptiden gesyn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Referências
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Química. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
