Specificitet Analys av protein lysin metyltransferaser Använda SPOT Peptide matriser
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lysin metylering är en framväxande modifiering efter translation och det har identifierats på flera histon och icke-histonproteiner, där den spelar avgörande roller i cellutveckling och många sjukdomar. Cirka 5.000 lysin metylering platser identifierades på olika proteiner, som fastställs av några tiotals protein lysin metyltransferaser. Detta tyder på att varje PKMT metylerar flera proteiner, men hittills bara en eller två substrat har identifierats för flera av dessa enzymer. För att närma sig detta problem, har vi infört peptid array baserad substratspecificitet analyser av PKMTs. Peptid arrayer är kraftfulla verktyg för att karakterisera specificitet PKMTs eftersom metylering av flera substrat med olika sekvenser kan testas på en matris. Vi syntetiserade peptid arrayer på cellulosa membran med hjälp av en Intavis SPOT synt och analyserat specificitet olika PKMTs. Baserat på resultaten, för flera av dessa enzymer, roman substrates kunde identifieras. Till exempel för NSD1 genom användning peptid arrayer, visade vi att det metylerar K44 för H4-stället för den rapporterade H4K20 och dessutom H1.5K168 är det starkt föredraget substrat över den tidigare kända H3K36. Därför peptid arrayer är kraftfulla verktyg för att biokemiskt karakterisera PKMTs.
Introduction
Under de senaste två decennierna, flera rapporter visat på betydelsen av post-translationella modifieringar (PTM) i cellulär utveckling och flera sjukdomar som cancer, men nyligen protein lysin metylering har vuxit fram som en annan viktig PTM. Medan ursprungligen histon lysin metylering befanns vara en viktig kromatin märke, senare arbete visade också lysin metylering av flera icke-histonproteiner 1-4. Den sekventiella överföring av metylgrupper från S-adenosyl-L-metionin till ε-aminogruppen i lysinresterna katalyseras av en familj av enzymer som kallas protein Lysin metyltransferaser (PKMTs) som innehåller över 60 proteiner i det mänskliga genomet. PKMTs ursprungligen upptäcktes histon modifierande enzymer som metilat specifika lysinrest men senare rapporter visat att de också kunde metylera icke-histonproteiner 5. Hittills har cirka 5.000 lysin metylering platser identifierats på olika proteiner 6 </supp>, men de enzymer som ansvarar för dessa ändringar ofta inte identifieras. En anledning till detta är att specificitet flesta PKMTs inte har studerats i stor omfattning. Därför återkommande inträffar det att nya substrat av PKMTs upptäcks. Avsaknaden av en detaljerad kunskap om substrat specificitet PKMTs hindrar förståelse för deras biologiska funktion och roll. För att studera specificiteten hos en PKMT i detalj, måste metylering hos många peptidsubstrat som skiljer sig i en eller ett fåtal aminosyror mätas och jämföras, som i idealfallet sker med användning av peptid arrayer. Baserat på de resulterande specificitet profiler kan potentiella substrat av PKMTs identifieras som kan studeras ytterligare.
Peptid arrayer används allmänt verktyg för biokemisk analys av antikroppar, peptid modifierande enzymer och kartläggning av protein-proteininteraktionsställen (antikropp-antigen, receptor-ligand) 7-9. Flera hundra peptider behövs för such applikationer. Olika metoder finns tillgängliga för peptidsyntes, bland dem peptidsyntes på harts är mycket ofta används, men har sina begränsningar i genomströmning och det är relativt dyrt. Dessa frågor löstes med införandet av SPOT syntesmetod av Frank och kollegor 10. SPOT syntesmetoden tillåter syntes av flera hundra peptider parallellt och i genomsnitt är det billigt jämfört med hartssyntes. Peptiderna syntetiserade på cellulosamembran kan användas antingen direkt för olika tillämpningar eller peptider kan klyvas från membranet och användas som fria peptider i lösningsanalyser eller för att framställa peptid microarrays 10-13.
SPOT-syntes är en variant av den i fast fas peptidsyntes, som använder ett cellulosamembran som en fast bärare och sysselsätter standard Fmoc-kemi 10-13. Följaktligen, vid syntes av peptidkedjorna börjar vid den C-terminala änden och fortsätter i riktning motden N-terminala änden i motsats till den biologiska syntesen i ribosomer. Cellulosa membran funktion för att fästa den första aktiverade aminosyror (fig. 1). SPOT-metoden är baserad på den sekventiella leveransen av aktiverade aminosyror i en droppe av lösningsmedel till definierade fläckar på membranet med användning av ett automatiserat pipetteringssystem. Droppen av vätska avges på det porösa membranet där det bildar en cirkulär våt fläck, som senare fungerar som en öppen reaktor för de kemiska reaktionerna i peptidsyntes. Punktstorleken bestäms av den volym som dispenseras samt absorptionsförmåga av membranet, är multiplar av sådana fläckar anordnade som matriser. Omfattningen av syntesen korrelerar med fläckstorlek och lastkapacitet av membranet. Avståndet mellan fläckarna och tätheten av arrayer hanteras genom att variera punktstorlekar. Cellulosamembran har flera fördelar som fast fas inom peptidsyntes, är det billigt, tolerant mot Chemicaals som används i peptidsyntes, stabila i vattenhaltiga lösningar och lätt att hantera. Dessutom gör den lämplig för flera biologiska testsystem dess hydrofila karaktär. SPOT-syntes kan utföras manuellt eller automatiserat (för 1000s av peptider), beroende på det erforderliga antalet peptider. En helautomatisk SPOT synt från Intavis (Köln, Tyskland) används för våra applikationer. Det tillåter syntes av peptider i olika mängder och av olika längd. Linjära peptider regelbundet syntetiseras med 15-20 aminosyralängd, i additions peptider av upp till 42 aminosyror kan också framställas genom stegvis syntes 14,15. Men att öka antalet aminosyror leder till minskningar i de totala kopplingsutbyten, vilket påverkar kvaliteten på peptiderna. På grund av den låga mängden peptider per fläck, produkterna är ofta svåra att rena och kvaliteten på individuella peptider kan inte vara lätt bedömas. Därför är resultaten som erhålls från SPOT Peptide arrayer måste bekräftas antingen med peptider syntetiserade genom standardmetoder i större skala, som kan renas och analyseras enligt standard i peptidsyntes eller genom att syntetisera de proteiner som innehåller de önskade peptidsekvenserna. Ändå fann vi SPOT syntes vara mycket tillförlitliga och resulterar i allmänhet att vara reproducerbar. SPOT-syntes är inte begränsad till proteinogena aminosyror, flera kommersiellt tillgängliga modifierade aminosyror även kan användas för syntes, vilket gör att peptider som skall modifieras före och efter den slutliga klyvningen av sidokedjeskydd grupp och dessutom, gör det också inkorporering av fosforylerade, metylerade eller acetylerade aminosyror 11.
Immobiliserade peptidbibliotek syntetiseras av SPOT metoden kan direkt användas för många biologiska och biokemiska analyser. Vi använde peptid arrayer som innefattar 300-400 peptider för att undersöka substratspecificiteten hos PKMTs. För enzymatisk modifikatjon, är peptid arrayer inkuberades med respektive PKMT och märkt [metyl-3H] -AdoMet i en lämplig buffert. Metyleringen av respektive substrat analyseras genom att följa den enzymatiska överföringen av de radioaktivt märkta metylgrupper från AdoMet till peptidsubstratet via autoradiografi (Fig. 3). Genom detta förfarande, peptid arrayer tillåter studiet av metylering av olika peptidsubstrat på samma gång. En viktig fördel med denna metod är att alla peptiderna metyleras i konkurrens, så att under den linjära fasen av metyleringen kinetik, är proportionell mot den katalytiska hastighetskonstanten dividerat med dissociationskonstanten (kcat / den relativa metylering av varje peptid D) av enzymet för respektive peptidsubstratet. Därför är mängden radioaktivitet införlivad i varje fläck direkt korrelerad med den enzymatiska aktiviteten mot särskild peptid. AnvändaResultaten av en peptid array metylering experiment kan definieras och baseras specificiteten profilen för PKMT om denna nya substrat förutsätts vara. Peptid arrayer möjliggöra ett snabbt och kostnadseffektivt validering av metylering av nya substrat på peptidnivå. För detta är arrayer bereds som innehåller de förutspådda nya substrat tillsammans med modifierade peptider innehållande en Ala istället för Lys på målgrupp webbplatser samt positiva och negativa kontrollpeptider. Slutligen kan de nya substraten framställas som proteiner tillsammans med mutanter, i vilken målet Lys är ändrat till Ala och metyleringen kan bekräftas på proteinnivå. Beroende på resultaten, detta sedan följs av biologiska studier som tar upp eventuella roller för metylering av de nyligen beskrivna proteinsubstrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPOT-syntes som beskrivs här är en kraftfull metod för att kart protein-proteininteraktioner platser och undersöka substrat erkännande av peptid modifierande enzymer. Emellertid har SPOT syntes fortfarande vissa nackdelar, eftersom även om peptiderna syntetiseras av SPOT metod rapporteras ha mer än 90% renhet 21 detta är svårt att bekräfta i varje instans. Därför resultat måste reproduceras av andra metoder för exempelvis med hjälp av proteindomäner eller med renade peptider syntetiseras av st…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
Referências
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Química. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
