Avaliação da viabilidade de gordura humana injecção em ratinhos nu com Micro-Tomografia Computadorizada

Resumo

A lipoenxertia é uma técnica essencial para a reconstrução de déficits de tecidos moles. No entanto, continua sendo um procedimento imprevisível caracterizado por sobrevida variável do enxerto. Nosso objetivo foi criar um modelo de camundongo que utiliza um novo método de imagem para comparar a retenção de volume entre diferentes técnicas de preparação e entrega de enxerto de gordura.

Resumo

Lipotransfer é uma ferramenta essencial em arsenal do cirurgião para o tratamento de défices de tecidos moles de todo o corpo. A gordura é o ideal de enchimento de tecido mole, uma vez que é prontamente disponível, facilmente obtido, de baixo custo, e inerentemente biocompatível. ¹ No entanto, apesar da sua popularidade crescente, enxerto de gordura é dificultada pelos resultados imprevisíveis e sobrevivência do enxerto variável, com as taxas de retenção publicados que variam de 10 -80%. ^1-3

Para facilitar a investigação sobre o enxerto de gordura, que, por conseguinte, ter desenvolvido um modelo animal que permite a análise em tempo real de retenção do volume injectado gordura. Em resumo, um pequeno corte é feito no couro cabeludo de um ratinho nu CD-1 e 200-400 ul de lipoaspirado processado é colocado sobre o crânio. O couro cabeludo é escolhido como o local receptor por causa da sua ausência de gordura subcutânea nativa, e por causa da excelente contraste de base fornecida pela calote craniana, o que ajuda nao processo de análise. Tomografia Micro-computadorizada (micro-CT) é usado para digitalizar o enxerto na linha de base e cada duas semanas. As imagens de TC são reconstruídos, e um software de imagem é usado para quantificar os volumes de garfo.

Tradicionalmente, as técnicas para avaliar o volume de enxerto de gordura exigiram a eutanásia do animal estudo para fornecer apenas uma única avaliação de peso e volume do enxerto por medição física ex vivo. Comparações bioquímicos e histológicos têm igualmente necessária o animal estudo a ser sacrificados. Esta técnica de imagem descrita oferece a vantagem de visualizar e quantificar objetivamente o volume em diferentes períodos após a enxertia inicial sem ter que sacrificar o animal estudo. A técnica é limitada pelo tamanho da prótese capaz de ser injectado como enxertos de pele de riscos maiores e necrose gordura. Este método tem utilidade para todos os estudos que avaliam a viabilidade do enxerto de gordura e retenção de volume. Ele é particularmente bem adaptado para Providing uma representação visual do enxerto de gordura e seguindo as variações de volume ao longo do tempo.

Introdução

Os defeitos dos tecidos moles surgem de uma variedade de causas, incluindo trauma, ressecção tumoral, envelhecimento e anomalia congênita. Eles podem ser debilitantes para os pacientes e representam um dos problemas mais comuns, mas desafiadores, para os cirurgiões reconstrutivos. Existem muitos métodos para tratar deficiências de tecidos moles, como retalhos locais e livres, injeções de colágeno e preenchimentos sintéticos. ^4-8 No entanto, desde seu primeiro uso documentado por Neuber em 1893¹, a transferência de gordura autóloga continua sendo o padrão-ouro para o reparo de déficits de tecidos moles, pois está pronta, é fácil e segura de colher e naturalmente compatível. ^1,2

Apesar dessas vantagens, os enxertos de gordura autóloga sofrem de sobrevida imprevisível e variável, com taxas de retenção variando de 10 a 80% ao longo do tempo. ^1-3,9 Para explicar essa perda esperada de volume e simetria, os cirurgiões muitas vezes devem corrigir demais ao preencher defeitos de tecidos moles ou realizar vários procedimentos de acompanhamento.

Leitos de enxerto mal vascularizados são parcialmente culpados por essa reabsorção tecidual. Além disso, a falta de um método de análise de referência para comparar a sobrevida do enxerto também pode contribuir para a inconsistência nos resultados relatados. Um método preciso para medir o volume do enxerto reduziria o erro de medição ao avaliar as taxas de retenção. Isso, por sua vez, ajudaria os pesquisadores a identificar com mais precisão os fatores causais que afetam a sobrevivência do enxerto. Embora muitos modelos de animais de laboratório tenham facilitado a avaliação quantitativa e qualitativa da sobrevida do enxerto de gordura humana, a maioria é baseada em meios histológicos e bioquímicos e requer o sacrifício do animal de estudo para produzir uma única medição. ^3,10-12 Pouco tem sido relatado sobre o uso de técnicas de imagem para enumerar a retenção de volume do enxerto de gordura in vivo.

Um punhado de estudos clínicos mostrou técnicas de medição mais eficazes usando imagens. A ressonância magnética (RM) foi empregada por Hörl et al. para medir a sobrevida do enxerto de gordura¹³, e a TC foi utilizada por Har-Shai et al. e Fontdevila et al. em suas análises de retenção de volume após enxerto em pacientes que sofriam de HIV. ^14,15 Empregando software de imagem tridimensional (3D), Meier et al. mediu a retenção de volume em humanos após lipoenxertia autóloga comparando imagens do pré-operatório e pós-operatório. ¹⁶

No entanto, falta um método padronizado que empregue imagens para medir a sobrevida do enxerto de gordura na pesquisa científica básica. Uma abordagem de imagem de alta resolução para avaliar os volumes dos enxertos de gordura permitiria não apenas medidas de volume precisas e reprodutíveis, mas também medidas repetidas, permitindo a visualização da evolução da sobrevida do enxerto de gordura em tempo real.

Protocolo

NOTA: Os protocolos experimentais e formulários de consentimento dos pacientes para a obtenção de gordura foram revisadas e aprovadas pela Universidade Institutional Review Board Stanford (Protocolo nº 2188). Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC) sob o protocolo nº 9999. Todos os experimentos foram realizados com a estrita observância a segurança do animal e orientações de cuidados humanos.

1. Fat colheita

1. Utilizando o procedimento Coleman ^17-19, obter o tecido adiposo humano do abdômen, flanco, e / ou regiões da coxa de pacientes saudáveis ​​do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletivo.
2. Para processar o lipoaspirado para enxertia, começar permitindo a gordura que se contentar com 30 min.
3. Lipoaspirado normalmente se instala em três camadas, com óleo, na parte superior, a gordura no meio, e sangue na parte inferior. Aspirar e descartar a camada de óleo superior e a camada de sangue inferior.
4. Para remover ainda mais qualquer tumesc restanteent fluido ou detritos celulares, centrifugar a gordura durante 5 min a 350 xg e 4 ° C, e aspirar a camada aquosa inferior.
5. Calcula-se a quantidade de gordura necessária para a enxertia, permitindo a entrega de 20% de erro, e transferir o volume desejado de gordura para 50 ml cónica (s). 400 multiplicar pelo número de ratinhos no estudo, para obter microlitros de gordura necessária para a enxertia.
6. Neste ponto, se realizando celular Assistida Lipotransfer ^20,21, o volume lugar de gordura para enxerto no gelo. Então colheita de células derivadas de tecido adiposo do estroma (ASC) da gordura remanescente usando a técnica padrão descrito por Zuk et al ^22.

2. lipoenxertia

1. Obter fêmea, ratinhos CD-1 nu homozigóticos para o estudo experimental. Escolha ratinhos entre 8-12 semanas de idade.
2. Para induzir a anestesia, o local do mouse em uma caixa de knockdown com 2,5% de mistura de isoflurano / oxigênio a 2 L / min por aproximadamente 10 min. Por favor, note que ISOF recomendadodose de lurane varia com o mouse tensão.
3. Quando a taxa de respiração do mouse abrandou, confirme sedação adequada com uma pitada dedo do pé. Aplicar veterinária lubrificante pomada oftálmica a ambos os olhos do mouse.
4. Se o mouse não se mexe em resposta aos pés pitada, isso confirma um avião suficiente de anestesia. Coloque o nariz do mouse em uma nosecone entregando 2,5% de mistura de isoflurano / oxigênio em 1-2 L / min. Se o mouse retrai de toe pitada, voltar para a caixa knockdown e reteste após 5 min.
5. Configure campo estéril sob mouse e, em seguida, esterilizar couro cabeludo com 2,5% iodopovidona seguido de solução de etanol a 70%. Repita mais duas vezes.
6. Coloque campos cirúrgicos sobre o mouse e ter o cuidado de manter o campo estéril. Instrumentos esterilizados, luvas e PPE deve ser usado em todos os momentos.
7. Se o volume de gordura a ser enxertado foi previamente colocado no gelo, permitir que a gordura se primeiro de ajustar a RT antes do parto.
8. Protelar a 1 ml seringa luer-lock com 1 mlde gordura.
9. Conectar um L 14, 8 cm, gordura cânula enxerto, para a extremidade da seringa.
10. Primeiro sistema pressionando o êmbolo da seringa até entre 200 e 400 ul de gordura permanece na seringa. Ao pressionar o êmbolo da seringa confirmar que a cânula se totalmente preenchido com gordura através da observação de gordura que sai do orifício de cânula distai.
11. Usando fórceps finos, levantar a pele dorsal na linha média que se sobrepõe ao caudal mais aspecto do crânio. Faça um 1,5 milímetros corte na pele usando uma tesoura fina.
12. Coloque um único fio de sutura 6-0 nylon através meio do corte que será posteriormente utilizado para trazer a ferida bordas juntos após a enxertia é realizada. Não amarre o fio de sutura.
13. Criar uma bolsa subcutânea sobre o crânio, inserindo a cânula através da incisão na pele e passando a cânula e para trás em um padrão em forma de leque sobre o crânio para libertar todos os anexos do tecido conjuntivo da pele sobrejacente.
14. Uma vez que a bolsa foi criada, posicione o cAnnula na linha média do rato directamente sobre o crânio até que a ponta se encontra no rostral mais aspecto do bolso, que deve ser apenas por trás de uma linha traçada entre os olhos. (Figura 1A)
15. Lentamente injetar a gordura em uma forma retrógrada, avançando o êmbolo enquanto puxa a cânula de volta. Utilizando uma pinça, trazer as bordas da ferida juntos e levantá-los para manter qualquer gordura de vazar para fora do bolso.
16. Amarre a sutura que foi previamente colocado, certificando-se que o primeiro nó situa-se levemente contra a pele. Amarre mais três nós quadrados e cortar o fio de sutura com uma cauda de 3 mm. (Figura 1B)
17. Confirme com a visualização e palpação manual que o bolso não está sobrecarregada e pele que recobre o bolso não é tensa. Se o bolso estiver muito cheio, corte o fio de sutura e retire toda a gordura de dentro do bolso. Lava-se a bolsa para fora com salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e re-injectar um volume menor de gordura.
18. Retire do rato a partir de umanesthesia e lugar em sua parte traseira ou lateral em uma gaiola limpa por si só. Monitorar o animal para a respiração regular, os movimentos normais, ausência de sangramento, e sinais de dor ou angústia. Administrar buprenorfina 0,1 mg / kg por via subcutânea a cada 6 horas até 48 horas, se o animal está com dor.
19. Certifique-se de que o animal tem de acordar o suficiente para manter decúbito esternal antes o abandona. Não coloque animais em uma gaiola com outros animais, até que se recuperou totalmente.
20. Após 4 horas, garantir que o animal é capaz de comer e beber, mover e respirar normalmente e que não há sangramento do local da cirurgia. Devolvê-lo para a instalação de cuidados com os animais.

3. Micro-CT

1. Camundongos Scan for o volume da linha de base por dia de pós-operatório 3, e em seguida, repita varreduras nas semanas de pós-operatório 2, 4, 6 e 8.
2. Quando imaginando os ratos em cada ponto do tempo, siga as orientações de sedação e de cuidados de animais pré e pós-processuais, conforme descrito anteriormente em SPTE 2,2-2,4 e 2,17-2,19.
3. Realizar varreduras em um scanner de micro-CT com um tamanho reconstrução voxel de 100 m ou melhor.
4. Com um pico de raios-X quilovoltagem de 80 kVp e uma corrente de ânodo de 450 mA, administrar uma dose de ração de aproximadamente 5 centiGy durante uma 9 min de digitalização para cada rato. Por favor note que estes valores variam dependendo do protocolo de verificação.
5. Antes de realizar a primeira varredura, calibre micro-CT com um fantasma de imagem que distingue entre o ar, a água ea intensidade óssea.
6. Coloque quatro ratos em scanner para a posição ventral com dois ratos no topo e dois na parte inferior. A mesa de digitalização pode ser facilmente construído utilizando 60 ml seringas para segurar o corpo do mouse e 10 ml seringas como cones de nariz ^23.
7. Manter os ratos sob anestesia com uma mistura de isoflurano / oxigénio 2,5% em 1-2 L por min.
8. Confirme imagem Escuteiro com que todo o crânio do rato, do nariz à primeira vértebra cervical, e da parte superior do crânio para a base de skull, vai ser trabalhada.

Análise 4. Micro-CT

1. Abra as imagens reconstruídas com um micro-CT imaging software de análise que permite a criação de regiões de interesse (ROI de) selecionando voxels usando limiares de intensidade de pixel. Software também permite a criação de superfícies 3D através da interpolação dos voxels selecionadas, e para a análise de volume.
2. Comece por carregar as imagens reconstruídas CT em bidimensional (2D) coronal, axial e sagital. (Figura 2A)
3. Usando o corte axial, como um guia, para navegar a fatia sagital que corresponde à face mais à esquerda do enxerto de gordura. Escolher um limite superior e inferior para a intensidade de pixel que capta todos os voxels correspondentes para o enxerto de gordura, mas que exclui o tecido circundante e osso. (Figura 2B)
4. Definir um ROI na visão sagital que corresponde ao enxerto de gordura usando limiares de intensidade de pixel previamente definidos. REPEAT esse procedimento a cada quinta corte sagital, navegando até a direita aspecto do enxerto é atingido. (Figura 2C)
5. Interpolar voxels selecionados de todas as ROI 2D de em um único, combinado ROI 3D. (Figura 2D)
6. Volume de ROI registro calculado pelo software.
7. Tornar o isosurface 3D para visualizar o volume final do enxerto de gordura. (Figura 2E)
8. Em análises posteriores, não se esqueça de manter os valores mínimos de limite máximo de intensidade de pixel e os mesmos que os utilizados para a análise de base.

5. Fat Colheita

1. Depois de camundongos foram digitalizadas para a semana 8 ^24,25 ponto de tempo, anestesiar os ratos como anteriormente descritos acima nos Passos 2,2-2,4 e 2,17-2,19.
2. Seguindo orientações Aplac, eutanásia os ratos, separando as suas colunas vertebrais.
3. Coloque o mouse no campo operatório. Com uma tesoura tenotomia, abra cuidadosamente o bolso e dissecar tele recobre anexos do tecido conjuntivo da pele e do enxerto de gordura.
4. Neste ponto, ele pode ajudar a extirpar um remendo da pele sobrejacente dorsal para ajudar na extração do enxerto. (Figura 3A)
5. Levemente manter a tração sobre o enxerto com uma pinça e transformá-enxerto de lado a lado para visualizar pontos sucessivos de tensão que precisam ser lançado com uma tesoura.
6. Ficar o mais próximo ao enxerto possível quando excisão para minimizar o tecido conjuntivo tomadas com o enxerto. (Figura 3B)
7. Após excisão do enxerto, medir a massa em uma escala tarado que é preciso, pelo menos, 0,01 gramas.
8. Calcular o volume do enxerto de gordura utilizando o valor de massa medida e a densidade média de gordura humana (0,9 g / ml) como uma taxa de conversão.
9. Compare volume calculado de enxerto de gordura à obtida com micro-CT.
10. Enxerto de gordura pode ser processado para histologia ou análise posterior se necessário.

Resultados

Enxertos de gordura diminuiu progressivamente em volume durante o curso do estudo, resultando em 62,2% de sobrevivência médio por Semana 8. (Figura 4A) ²⁴ Após a conclusão da verificação Semana 8, cada enxerto de gordura foi extraída em uma única peça. Utilizou-se um teste da soma de Wilcoxan para comparar a diferença entre as medições de volume de enxerto de gordura obtidos por ambos os micro-CT ou calculados a partir de massa física. Não foi encontrada diferença significativa entre os dois ...

Discussão

Até este ponto, a maioria dos pesquisadores basearam-se em modalidades não geradores de imagem para quantificar a sobrevivência a longo prazo de enxertos de gordura, mas estes métodos requerem o sacrifício do animal estudo e produzirá apenas uma única medição. ^3,10-12 Nosso estudo representa um método de análise melhorada que permite objectivo, a quantificação em tempo real de sobrevivência do enxerto de gordura num modelo de ratinho.

Crítica neste processo é assegurar que os rato...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Centrífuga lipoaspirada
	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
Tubos cônicos de 50 ml	BD Biosciences, San Jose, CA
Camundongos nus CD-1 (Crl: CD1-Foxn1nu< / sup>)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
Isoflurano	Henry Schein, Dublin, OH
2,5% Betadine	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
Solução de etanol a 70%	Gold Shield, Hayward, CA
Seringa luer-lock de 1cc	BD Biosciences, San Jose, CA
Cânula de calibre 14	Shippert Medical, Centennial, CO
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha
Tesoura de tenotomia	Fine Science Tools, Heidelberg, Alemanha
6-0 sutura de nylon	Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphate tampolado com solução salina	Gibco, Carlsbad, CA
micro-CT scanner	Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Phantom	TriFoil Imaging, Northridge, CA
Software de análise de imagem	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
Scale	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH